酶法水解乳清的研究

材料与方法

1.1   试验材料

乳清，新鲜无抗牛乳制备干酪后所得到的副产物;碱性蛋白酶，山西农业大学畜产实验室提供;氢氧化钠（分析纯），天津市顶福化工总厂提供。

1.2   试验设备

pH值自动控制仪，上海海雷磁仪器厂产品;水浴恒温振荡器，上海跃进医疗器械厂产品;ALC- 210.2型电子分析天平，上海精密科学仪器有限公司产品。

1.3   试验方法

1.3.1   乳清水解工艺流程

乳清→于80 ℃下振荡水浴加热15 min→調节pH值→降至所需温度→酶法水解→加热钝化→测水解度。

1.3.2   水解度的测定[6]

水解开始时，调节反应体系的pH值为7.0，利用pH自动控制仪实时对反应体系的pH值进行在线控制，以维持反应体系恒定的pH值。每隔一定时间记录浓度为0.5 mol/L的NaOH碱溶液的消耗量，按下式计算出乳清蛋白的水解度：

DH=B（Mb）（1/α）（1/Mp）（1/h）×100%.

式中：B——NaOH的体积，mL;

Mb——NaOH的浓度，mol/L;

Mp——水解液中蛋白质的质量，g;

h——每1 g原料蛋白质中肽键的毫摩尔数，对

于乳清浓缩蛋白而言，该值取8.8;

1/α——校正系数（碱性蛋白酶的1/α=1.01）。

1.3.3   试验设计

影响乳清水解反应的主要因素有水解温度、初始pH值、酶与底物浓度比和水解时间。先进行单因素试验，在各单因素试验结果基础上，以正交试验设计优化碱性蛋白酶对乳清蛋白的水解条件。对酶与底物浓度比（A）、初始pH值（B）、酶解温度（C）和酶解时间（D）进行正交试验设计。

正交试验因素与水平设计见表1。

2   结果与分析

2.1   水解温度对水解度的影响

温度对酶解反应效率的影响主要在酶催化反应的速度和酶的稳定性2个方面。通常情况下碱性蛋白酶的最适温度随着底物的不同而有所不同，但一般都是在50～60 ℃，将碱性蛋白酶的条件设定在pH值9，酶与底物浓度比（E/S）0.03，对乳清蛋白水解3.0 h，以水解度为指标，探讨不同水解温度条件下乳清的水解度。

水解温度对水解度的影响见图1。

由图1可知，随着温度越来越高，水解度越来越大。在40～50 ℃，水解度上升得比较缓慢;在50～60 ℃水解度上升的比较快，这个现象主要是因为碱性酶在其最适温度下，反应物间分子间的接触更加频繁，50～60 ℃酶的活性比较强，反应速度就比较快。水解温度在60 ℃时效果最好，但是由于考虑到可能在此温度水解后，会有美拉德反应以致水解后的产物颜色变深，所以实际选择的最适温度为55 ℃。

2.2   初始pH值对水解度的影响

由结果可知，碱性蛋白酶最适温度为55 ℃，设定酶和底物比（E/S）为0.03，酶解时间3.0 h，水解度为指标。

pH值对水解度的影响见图2。

由图2可知，碱性蛋白酶的pH值为8时水解度较低;pH值在8.0～10.0时，水解度随pH值的增加而加快;当pH值超过10.0时水解度开始下降，水解液的颜色越来越深。碱性蛋白酶在最大活性范围内，选用较低的pH值会减少反应过程产生的盐，所以最终选择pH值为9。

2.3   酶与底物浓度比（E/S）对水解度的影响

由于在试验中碱性蛋白酶水解时，底物的量是绝对过量的，在决定酶的用量时，相对于酶的浓度，酶和底物浓度比可以更准确地表现酶的反应速率。因此，反应速率是和E/S成正比的。由试验可知，pH值9，水解温度55 ℃的条件合适。

E/S对水解度的影响见图3。

由图3可知，E/S为0.03～0.05时，随着E/S的增大，酶解液的水解度越来越大;E/S在0.05之后，水解度增加很缓慢。所以，从水解度的变化和生产成本综合考虑，E/S选择0.05。

2.4   水解时间对水解度的影响

由以上试验确定的值，设定酶解的条件为水解温度55 ℃，pH值9，酶和底物比（E/S）為0.05，以水解度为指标。

水解时间对水解度的影响见图4。

由图4可知，在整个水解过程中，随着时间不断增加，水解度也越来越大，不过每个时间段增加的程度不一样。在开始的1 h内，水解度增加的最快，主要是由于水解最开始时，碱性蛋白酶主要作用的肽键数目最多，随着水解时间的增加，肽键被断开的越来越多，水解底物中的肽键数越来越少，此后水解度增加的程度虽然仍然呈现上升的趋势，但越来越慢。为节约时间和能源，最终乳清蛋白的最适水解时间为3.0 h。

2.5   乳清水解条件的优化

在单因素试验结果的基础上，再对酶与底物浓度比、初始pH值、水解温度和水解时间4个条件下进行L9（34）正交试验，确定碱性蛋白酶水解乳清蛋白的最佳工艺参数组合。

正交试验结果见表2。

由极差分析的结果可知，影响乳清蛋白水解度的因素主次关系为A>B>D>C，即酶与底物浓度比>初始pH值>水解时间>水解温度。由于碱性蛋白酶水解中，底物是绝对够量的，水解的程度则完全取决于酶的浓度，因此酶与底物浓度比是影响乳清蛋白水解度最大的因素，其次是pH值，最后是水解时间和水解温度，由试验所得和正交分析可知最佳条件参数组合为A1B3C3D3，9个处理组合中水解度最高的也是A1B3C3D3组合，所以碱性蛋白酶水解乳清的最佳条件为水解温度60 ℃，pH值10，E/S 0.06，水解时间4 h。

3   结论

由于乳清蛋白分子中有较多的疏水氨基酸残基，因此碱性蛋白酶能对乳清蛋白进行有效的水解。试验利用了正交试验对碱性蛋白酶水解乳清的条件进行了研究，主要研究了水解乳清过程中酶与底物浓度比、初始pH值、水解温度和水解时间对反应的影响，并且对其进行了优化。结果表明，影响碱性蛋白酶水解乳清的因素按影响大小依次为酶与底物浓度比、初始pH值、水解时间、水解温度。碱性蛋白酶水解乳清的最佳酶与底物浓度比0.06，初始pH值10，水解温度60℃，水解时间4 h，在以上工艺条件下，乳清蛋白的水解度可达21.92%。

参考文献：

[1] 郭本恒，孔保华. 保健与功能食品[M]. 哈尔滨：黑龙江科学技术出版社，1996：136-145.

[2] 张俊英，王彩云，靳烨，等. 酶水解乳清蛋白工艺条件的研究[J]. 农产品加工，2009（6）：33-36.

[3] 包怡红. 功能性乳清的综合利用[J]. 食品与机械，2001（1）：9-11.

[4] 万国余. 发酵乳制品工艺技术[J]. 中国乳品工业，1991（2）：101-109.

[5] Owen R. Fennema. 食品化学[M]. 第3版. 北京：中国轻工业出版社，2003：245-260.

[6] 赵新淮，冯志彪. 大豆水解物水解度测定的研究[J]. 东北农业大学学报，1995，26（2）：176-183. ◇