分子生物学诊断技术的应用(一)

中图分类号:S854.4+3文献标识码:B文章编号:1007-273X(2010)09-0004-06

编者按:随着分子生物学技术的飞速发展,尤其是分子遗传学的进步,大大提高了动物病原的诊断水平。动物病原的实验室诊断技术已从常规的病原分离鉴定以及抗原和抗体的免疫学检测,进入到可对病原基因序列和结构直接进行测定的分子生物学水平,同时也促进了疫病快速诊断技术发展。近几年随着国家对市县级动物疫病防控设备投资逐年加大,疫病防控诊断平台建设不断加强,兽医技术人员希望普及动物分子生物学诊断技术。本刊特邀湖北省农业科学院畜牧兽医研究所杨峻研究员对分子生物学诊断技术在兽医学科领域的应用进行概述,为大家在实际应用时提供参考。主要内容包括核酸探针技术、单克隆抗体技术、核酸扩增、核酸电泳、免疫印迹技术、图谱分析、核酸序列分析、DNA芯片技术等。

1核酸探针技术

1.1核酸探针技术的原理

化学及生物学意义上的探针(Probe),是指与特定的靶分子发生特异性相互作用,并可被特殊的方法探知的分子。抗体—抗原、生物素—抗生物素蛋白、生长因子—受体的相互作用都可以看做是探针与靶分子的相互作用。核酸探针技术的原理是碱基配对。互补的两条核酸单链通过退火形成双链,这一过程称为核酸杂交。核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段,它能和与其互补的核酸序列杂交,形成双链,所以可用于核酸样品中特定基因序列的检测。每一种病原体都具有独特的核酸片段,通过分离和标记这些片段就可制备出探针,用于疾病的诊断等研究。

1.2核酸探针的种类与用途

按来源及性质划分:可将核酸探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。作为诊断试剂,较常使用的是基因组DNA探针和cDNA探针。其中,前者应用最为广泛,它的制备可通过酶切或聚合酶链反应(PCR)从基因组中获得特异的DNA后将其克隆到质粒或噬菌体载体中,随着质粒或噬菌体的增殖而获得大量高纯度的DNA探针。将RNA进行反转录,所获得的产物即为cDNA探针适用于RNA病毒的检测。cDNA探针序列也可克隆到质粒或噬菌体中,以便大量制备。将RNA标记也可作为核酸分子杂交的探针,但由于来源极不方便,且RNA极易被环境中大量存在的核酸酶降解,操作不便,因此应用较少。用人工合成的寡聚核苷酸片段作为核酸杂交探针应用十分广泛,可根据需要随心所欲合成相应的序列,可合成仅有几十个bp的探针序列,对于检测点突变和小段碱基的缺失或插入尤为适用。

按标记物划分:有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。放射性标记探针用放射性同位素作为标记物。放射性同位素是最早使用,也是目前应用最广泛的探针标记物。常用同位素有32P、3H、35S。其中,以32P应用最普遍。放射性标记的优点是灵敏度高,可以检测到Pg级;缺点是易造成放射性污染,同位素半衰期短,不稳定,成本高等。因此,放射性标记的探针不能实现商品化。目前,许多实验室都致力于发展非放射性标记的探针。

目前应用较多的非放射性标记物是生物素(biotin)和地高辛(digoxigenin)。两者都是半抗原。生物素是一小分子水溶性维生素,对亲合素有独特的亲和力,两者能形成稳定的复合物,通过连接在亲合素上的显色物质(如酶、荧光素等)进行检测。地高辛是—种类醇半抗原分子,可利用其抗体进行免疫检测,原理类似于生物素的检测。地高辛标记核酸探针的检测灵敏度可与放射性同位素标记的相当,而特异性优于生物素标记,其应用日益广泛。

核酸探针技术是目前分子生物学中应用最广泛的技术之一,是定性或定量检测RNA或DNA序列的有力工具。核酸探针可用以检测任何特定病原微生物,并能鉴别密切相关的毒(菌)株和寄生虫。目前,各种常见病毒病的诊断和研究都已应用到核酸探针技术,这方面的研究报道数以万计且与日俱增。但该项技术的操作毕竟比常见方法复杂,费用较高,在动物检疫中尚未推广。多在实验室内对病原作深入研究时使用。

1.3核酸探针的标记方法

1.3.1放射性同位素标记法将放射性同位素如32P连接到某种脱氧核糖核苷三磷酸上为标记物,然后通过切口平移法标记探针。

切口平移法(nick translation)是利用大肠杆菌DNA聚合酶I(E. coli DNA polymerase Ⅰ)的多种酶促活性将标记的dNTP掺入到新型DNA链中去,形成均匀标记高比活DNA探针。其操作方法如下:取1μg DNA溶于少量无菌双蒸水中,加入5μL距离大约10×切口平移缓冲液(0.5mol/L Tris-HCl,pH7.2;0.1mol/L MgSO4;1mmol/L二硫苏糖醇;500μg/mL牛血清白蛋白),加入除标记物(如α-32P-Datp)外的其他3种dNTP(如dCTP、dGTP、dTTP)溶液、20mmol/L溶液各1μL;加入10μL标记物溶液,加入无菌双蒸水至终体积为46.5μL,混匀,加入0.5μL稀释的Dnase 1溶液,混匀;加入1μL E.coli DNA polymerase I,混匀;置14～16℃反应1～2h。

1.3.2非放射性标记法将生物素、地高辛连接在dNTP上,然后象放射性标记一样用酶促聚合法掺入到核酸链中制备标记探针。也可让生物素、地高辛等直接与核酸进行化学反应而连接上核酸链。其中,生物素的光化学标记法较为常用。其原理是利用可能被可见光激活的生物素衍生物——光敏生物素,光敏生物素与核酸探针混合后,在强RNA的标记,探针可在-20℃下保存8～18个月。具体操作方法如下:将双链DNA变性或用NaOH处理形成缺口(单链DNA或RNA毋需处理),将核酸样品溶于水;暗室下在微量离心管中加入10μg DNA,1mg/L光敏生物素20μL,加水至50μL,混匀;冰浴中打开离心管盖,在300～500W灯下照射10min(液面距灯泡10cm);加入100μL 0.1mol/L Tris-HCI,pH8.0,加入100μL 2-丁醇抽提两次,离心,弃上层;乙醇沉淀核酸探针;用70%乙醇漂洗,真空抽干,备用。

1.4核酸杂交方法

杂交技术有固相杂交和液相杂交之分。固相杂交技术目前较为常用,先将待测核酸结合到一定的固相支持物上,再与液相中的标记探针进行杂交。固相支持物常用硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane,简称NC膜)或尼龙膜(nylon membrane)。

固相杂交包括膜上印迹杂交和原位杂交。前者包括三个基本过程:第一,通过印迹技术将核酸片段转移到固相支持物上;第二,用标记探针与支持物上的核酸片段进行杂交;第三,杂交信号的检测。用探针对细胞或组织切片中的核酸杂交并进行检测的方法称之为核酸原位杂交。其特点是将靶分子固定在细胞中,细胞固定在载玻片上,以固定的细胞替代纯化的核酸,然后将载玻片浸入溶有探针的溶液里,探针进入组织细胞与靶分子杂交,而靶分子仍固定在细胞上,据此可以判定有无该病原体的感染等。原位杂交不需从组织中提取核酸,对于组织中含有极低的靶序列也有极高的敏感性,在临床应用上有独特的意义。

近年来液相杂交技术有所发展。液相杂交与固相杂交的主要区别是不用纯化或固定靶分子,探针与靶序列直接在溶液里作用。液相杂交步骤有所简化,速度有所提高,增加了特异性和敏感性,但与临床诊断所要求的特异性和敏感性还有一定的距离。

各种杂交技术中,膜上印迹杂交技术应用最为广泛。

1.5核酸印迹技术

斑点印迹(dot-blot):将待测核酸样品变性后直接点样在膜上,称之为斑点印迹。为使核酸牢固结合在膜上,通常还将点样后的膜进行80℃真空烘烤2h。应用斑点印迹技术,可在一张膜上同时进行多个样品的检测,操作简便、快速,在临床诊断中应用较广。适合进行特定基因的定性及定量研究。但不能鉴定所测基因的分子量。

Southern印迹(southern blot):这是指将DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离后转移到固相支持物上的过程。常规处理如下,先用限制性内切酶对DNA样品进行酶切处理,经琼脂糖凝胶电泳将所得DNA片段按分子量大小分离,接着对凝胶进行变性处理,使双链DNA解离成单链,并将其转移到NC膜或其他固相支持物上,转移后各DNA片段的相对位置保持不变。用探针与经Southern印迹处理的DNA样品杂交,可鉴定待测DNA的大小、进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析(RFLP)等。

2单克隆抗体技术

2.1单克隆抗体技术应用原理与研究进展

2.1.1单克隆抗体技术应用原理针对病原某一特异蛋白制备的抗体通过淋巴细胞杂交瘤技术进行纯化生产(简称单抗),单抗作为抗原物质的分子识别工具除在生物医学基础研究、免疫和治疗方面得到广泛应用外,在疫病诊断和检疫中正在并将继续发挥重要作用。

单克隆抗体与多克隆抗体的本质区别:单克隆抗体是源于一个B淋巴细胞的杂交瘤细胞分泌的针对抗原的同一表位的抗体;而多克隆抗体(简称多抗)是由免疫动物的无数不同的B淋巴细胞分泌的针对抗原不同表位的性质各异的混合抗体。单抗是同质的,多抗是异质的。把握单抗与多抗的这些重要区别,对于正确应用这两类抗体是十分重要的。

2.1.2单克隆抗体技术研究进展自1975年建立该项技术以来,目前已取得新的重要进展,主要有以下几方面。

融合技术。除用聚乙二醇融合剂外,发展了融合、激光融合和定向融合技术。用FOX系骨髓瘤细胞与Rb8-12Balb/c动物脾细胞融合,存活的杂交瘤细胞均能分泌抗体。有的细胞生长因子可促进瘤细胞生长,在融合和克隆时把它加进培养液中,可不加饲养细胞,并能提高融合率、克隆成活率和阳性率。

发展了异源和非鼠源杂交瘤。用动物骨髓瘤细胞与其他动物(如兔、牛、猪、绵羊等)脾细胞融合,获得异源杂交瘤。但融合率低,稳定性差。近年来报道了鸡和猪骨髓瘤细胞系研究成功,为研究鸡和猪源单抗准备了前提条件。

发展了双特异性抗体。这是两种分泌不同单抗的杂交瘤细胞间融合产生的杂交瘤。其方法是先研制对HAT敏感的亲本杂交瘤细胞,然后与另一杂交瘤细胞融合,筛选。筛选出的杂交瘤分泌的单抗为双特异性。如单抗的一臂结合过氧化物酶,另一臂结合抗原,省去标记酶的过程。

发展了嵌合抗体、重构抗体和小分子抗体。嵌合抗体是应用重组DNA技术对抗体基因进行置换,从而改变原来抗体性质。如用编码HRP或AP酶基因取代鼠单抗C区基因,表达产物既具有抗体活性,又具有酶活性;再如将毒素分子的编码基因与单抗V区基定簇互补的结构,即互补性决定区(CDR)基因取代入抗体可变区的CDR基因,表达具有动物单抗特异性的源抗体。通过DNA重组技术可以得到大小为完整IgG 1/3的FabA片段、为完整IgG 1/6的只由重链可变区构成的单链抗体以及为完整IgG分子1/12的只有VH区的单域抗体。

免疫球蛋白与抗原的结合主要决定于重链,轻链作用差些。一些不同特异性的抗体的VL区很相似。因此抗体基因库中VH基因与有限数目的VL基因排列组合可以构成任何需要的抗体。抗体基因工程可按人的需要构建新的抗体分子,将从根本上改变领先免疫获得抗体的状况。

2.2单克隆抗体的应用

自1975年Kohler和Mitstein报道,通过细胞融合建立能产生单克隆抗体的杂交瘤技术以来,这个最基础的具有开创性的理论在生物科学的基础研究以及医学、预防医学、农业科学等领域的广泛的实践,充分显示它对生命科学各领域产生的巨大而深远的影响。由于单抗有着免疫血清或抗体无法比拟的优点,迄今全世界已研制成数以千计的单抗,有的已投入市场,有的正在进行应用考核和深入观察。

2.2.1在诊断学中的应用单抗应用最广泛的是诊断,主要用于病原诊断、病理诊断和生理诊断,随着微生物学、寄生虫学、免疫学的研究进展,人类对感染性和寄生虫性疾病有了新的认识,一个病原体存在许多性质不同的抗原,在同一抗原上,又可能存在许多性质不同的属、种、群、型特异性抗原,采用杂交瘤技术,可以获得识别不同抗原或抗原决定簇的单抗,从而可以对感染性疾病和寄生虫病进行快速准确的诊断,同时可以用于调查疾病流行情况,流行毒株或虫株分类鉴定,为病原的防疫治疗提供资料。目前应用单抗诊断试剂诊断的人、畜禽、植物等病毒、细菌或寄生虫病已有上百种,其中乙肝、狂犬病、乙型脑炎等人兽共患病30余种;鸡新城疫、马立克、猪瘟等畜禽病20余种;植物病毒病10余种;人、畜禽细菌病20余种;弓形虫、疟疾、旋毛虫等寄生虫病30余种。另外,单抗还成功应用于含量低微的激素、细菌毒素、神经递质的肿瘤细胞抗原的诊断。

2.2.2单抗应用于临床治疗用单抗治疗肿瘤是医学界寄予厚望的一项研究,目前已研制了的肿瘤单抗有:胃肠道肿瘤、黑色毒瘤、肺癌等数十种,用单抗可能的治疗途径是采用高亲并特异的单抗,偶联药物或毒素后(生物导弹)以定向杀伤肿瘤,目前该研究在实验动物中已获得成功,而单独使用单抗治疗人类恶性肿瘤获得成功的例子国外也有报道。使用单抗治疗畜禽传染病,尤其是病毒病如鸡传染性法氏囊,成效十分显著。近年来采用基因工程技术将抗体基因转入植物可以生产大量的单抗,另外具有不同用途的嵌合抗体、人源单抗、重构抗体、小分子抗体的出现,为应用单抗治疗各类疾病拓宽了道路。

2.2.3单抗是生物学研究的有力工具目前,单抗已广泛应用于不同学科,其中一部分是为基础理论研究服务的,在病原方面可用于分类、分型和鉴定毒株,可用于探查抗原结构以及用于抗感染免疫机制和中和抗原的研究,结合分子生物学方法,可以确认病毒抗原蛋白的编码基因,基因突变和转译产物的加工、处理、组装过程,从而进一步研制基因重组疫苗。作为一种特异的生物探针,通过单抗的免疫组化定位,研究细胞的生理功能和疾病的病因、发病机制,对激素和受体可应用单抗的免疫分析,免疫细胞的定位,大大促进了激素和受体结构与功能、激素作用机理以及内分泌自身免疫性疾病病因的研究进展。另外单抗已应用于神经系统、血液系统、药理学和系统发育学、畜牧育种及性别控制等学科的研究工作中,从而极大的推动了整个生物学科的发展。

2.3材料与试剂

细胞融合和杂交细胞培养用试剂的配制:

RPMI-1640基础培养液1 000mL:RPMI-1640粉7.4g,丙酮酸钠0.5g,用900mL三蒸水(或无离子水再经过双蒸),通CO2搅拌溶解。称取1.8g NaHCO3,用少量三蒸水溶解,边搅拌边加入RPMI-1640液中。补足1 000mL,通过0.22μm滤膜正压过滤除菌(用CO2钢瓶加压),分装,置30℃,菌检48h,4℃存放。有效期不超过3个月。

RPMI-1640完全培养液100mL:双抗(青、链霉素)1.0mL,3%L-谷氨酰胺2.5mL,犊牛血清15.0mL,1640基础培养液81.5mL。用时现配,4℃下存放不超过1周,用于细胞融合和克隆化培养的全培养液,可将小牛血清增至20%。

L-谷氨酰胺溶液200mL(3%):L-谷氨酰胺5.846g,三蒸水200mL;加热至50℃使全溶,0.22μm膜滤除菌,-20℃保存。

双抗溶液:青霉素(钠盐)100IU,链霉素(硫酸盐)1g,溶于100mL灭菌三蒸水中,小量分装,-20℃冻存。

筛选小牛血清的方法:取一份生长旺盛的杂交瘤细胞(或骨髓瘤细胞),按有限稀释法用不含血清的培养液稀释成每毫升5个和100个细胞,按每孔0.1mL分种于不含饲养细胞的96孔板中。其中,一部分板孔加待试小牛血清,一部分板孔加已知优良血清,每孔1滴(约0.025mL)。在37℃ 5%～7%CO2温箱中培养7d左右,计数每孔细胞克隆灵敏情况并估测群落大小,按克隆细胞的相对成活率和生长速度评价血清优劣。

50%聚乙二醇(PEG)溶液:取约3g PEG(MW 1520或4000)放入试管中,加盖包有硫酸纸的棉塞,121℃ 0.069~0.075MPa,高压灭菌10min。当融化的7.5% NaHCO3调pH值至7.1,用温热的吸管吹吸混拌均匀,按0.8mL/支分装在安瓿中,放-20℃冻存备用。

7.5%NaHCO3溶液:取7.5gNaHCO3溶于100mL三蒸水中,0.22μm膜滤除菌,分装小瓶中,4℃保存。

氨基喋呤(A)贮存液:取5.16mL氨基喋呤,加90mL三蒸水,滴加0.5mL NaOH助溶,待完全溶解后,加0.5mL 1mol/L HCl中和,补足三蒸水至100mL,0.22μm膜滤除菌,分装4mL/瓶,-20℃保存。

次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)贮存液:取13.61mL H和38.8mL T,加45～50℃三蒸水至100mL,使之溶解,0.22μm膜滤除菌,分装4mL/瓶,-20℃保存。

HT培养液:在完全培养液中按1%加HT贮存液。

HAT培养液:在完全培养液中分别按1%加A贮存液和HT贮存液。

8-氮鸟嘌呤贮存液:取20mL 8-氮鸟嘌呤加入1mL 1mol/L NaOH中,溶解后加三蒸水至100mL,0.22μm膜滤除菌,按4mL/瓶分装,-20℃保存。

8-氮鸟嘌呤培养液:向全培养液中按1%加入8-氮鸟嘌呤,即为含20μg/mL的全培养液。

2.4方法与操作

2.4.1抗原制备选用什么形式的抗原免疫动物?选用什么形式的抗原作筛检抗原?这是研制单抗设计中需要着重考虑的策略。一般来说,免疫原越纯,杂交瘤细胞的阳性率越高。某些抗原甚至不提纯,杂交瘤细胞也有相当高的阳性率。应根据研究对象的具体情况和研究目的而定。研制病毒特异性单抗往往经密度梯度离心或层析纯化过的病毒检抗原。但用粗提或不提纯的病毒抗原免疫动物也能获得成功。如以新城疫病毒浓缩尿囊液或疫苗、马立克氏病毒感染细胞的超声波粉碎抗原、口蹄疫病毒和猪水泡病病毒聚乙二醇或硫酸铵浓缩抗原作免疫抗原进行杂交瘤试验,均曾获得成功。研制细菌单抗往往用全菌或其裂解物作免疫抗原。研制抗原特定表位的单抗时需精心设计技术路线,如研制羊布氏菌疫苗弱毒菌株特有抗原成分单抗,先分析强弱菌株各种抗原成分,找出抗原,然后通过亲和层析法分离纯化抗原用于免疫和筛检。但是,研制不同型口蹄疫病毒12s抗原的群特异性单抗时,就不采取先分离群特异性抗原的技术路线,而是用一个型(A型)口蹄疫病毒12s抗原作免疫抗原,用另一个型(O型)口蹄疫病毒12s抗原作筛检抗原,获得成功。免疫抗原用鼠组织毒制备,不必精提,因为鼠源杂蛋白与Ballb/c动物是同种,应属弱抗原,显然,后者的技术路线比前者的简便得多。

2.4.2免疫免疫的目的是为了获得分泌特异性抗体的杂交瘤细胞,并使B细胞在抗原刺激下分化,易于细胞融合,通常选用与骨髓瘤细胞系同系动物进行免疫。如用动物骨髓瘤细胞系,则选用2～3月龄的Ball/c动物;如用大鼠骨髓瘤细胞系则选用Lou/c大鼠。采用什么样的免疫程序取决于具体抗原性状和免疫对象以及要制备什么样性质的单抗而定。但在多数情况下都是参照制备抗血清的常规免疫方法。基础免疫,如病毒抗原多用福氏腹腔注射无佐剂抗原。一般认为最后加强免疫采用静脉途径比腹腔好。具体方法:如制备口蹄疫病毒单抗,用福氏完全佐剂抗原,腹腔接种于Balb/c动物,每只20～30μg抗原,4～6周后用同样剂量的无佐剂抗原静脉注射,之后第3天取脾融合。用活毒免疫,方法简便,易获得IgM类中和单抗。如研制口蹄疫病毒单抗时所采用的活毒免疫法为:100LD50的O型口蹄疫病毒活毒,用适当剂量(接种待免疫的同龄动物至致死率为10%左右),腹腔接种90日龄Balb/c动物,之后第7天融合,可获得高滴度IgM类中和单抗。

此外,也有用其他动物的免疫脾细胞与动物骨髓瘤细胞融合,制备异源杂交瘤,生产非鼠源单抗。但这种杂交瘤不够稳定,染色体易丢失。在免疫方法上,还有把抗原直接注入困难、免疫原性差或对机体有害的抗原用作体外免疫。体外免疫的具体操作方法为:取脾细胞或外周血淋巴细胞制成单细胞悬液,用无血清培养液洗2～3次,然后悬浮于含10%小牛血清的全培养液中,加适量抗原(可溶性抗原一般为0.5～5.0μg/mL,细胞抗原为105～106个/mL),在37℃,5%～7%CO2箱中培养3～5d,即融合。

2.4.3融合和选择性培养饲养细胞的制备:在HAT培养液中加入饲养细胞可促进融合后杂交瘤细胞的生长。动物腹腔巨噬细胞、正常脾细胞、胸腺细胞均可作为饲养细胞。由于腹腔巨噬细胞清除死亡的能力强,制备方便,故最为常用。具体操作是:在融合前1～2d,取Balb/c动物3～4只,拉颈致死,浸入75%酒精中消毒体表,然后用大头针固定在蜡板上,在无菌条件下小心将腹部皮肤剪一小口(切勿剪破腹膜),剥离皮肤,暴露腹膜,用10mL注射器将5～7mL预冷的无血清培养液注入腹腔,不拔针头,用弯头镊子夹住针眼处的腹膜,固定针头,封住针口,用另一弯头镊子挤压、揉动腹部约1min,然后吸出注入液体,加入冰浴冷却的50mL尖底塑料离心管中。1 000r/min离心5～10min,弃上清,用10mL无血清基础培养液重悬定容,计数细胞;根据需要留取适量细胞悬液,离心弃上清,用HAT培养液重悬,使细胞浓度为1×105～2×105个/mL,加到96孔板中,每孔0.1mL,置37℃ CO2培养箱中待用。也可以在融合当天制备饲养细胞,加入HAT培养液中与融合细胞混合物一起分种于细胞板中。活细胞计数方法为:取0.1mL细胞悬液,加0.9mL 0.4%台盼蓝染液混匀,用血球计数板计数。死细胞为蓝色,活细胞不着色。镜检时,计数板四角大格内细胞数,压线者只计上线和右线细胞。

骨髓瘤细胞的培养:维持动物骨髓瘤细胞于最佳生长状态是融合成功的因素之一。这种细胞倍增时间一般为10～16h,在融合前一周内使其保持对数生长期。刚复苏的细胞需2周时间才能达到适于融合状态。融合时需收集2×107个以上骨髓瘤细胞。具体操作为:将细胞培养瓶中液体吸出,加入适量无血清基础培养液,用弯头吸管将细胞从瓶壁吹洗下来,用尖底塑料离心管收集细胞悬液,离心沉淀,弃上清,加入10mL无血清培养液重悬,进行活细胞计数。活细胞数应在90%。

为防止在传代过程中部分骨髓瘤细胞返祖,可用含1～20μg/mL 8-氮鸟嘌呤的完全培养液定期处理骨髓瘤细胞,使其对HAT呈均一敏感性。

免疫脾细胞的制备:取加强免疫后3d的Balb/c动物1～2只,先眶下窦采血,供测抗体用,然后拉颈致死,浸入75%酒精中体表消毒,无菌剥离腹部皮肤,剪开腹膜,取脾,去脂肪和结缔组织,放入约含5mL无血清培养液的平皿中的铜网上,用弯头镊子挤压研磨,使细胞分散在液体中,弃渣,离心沉淀,弃上清,加入10mL无血清培养液重悬,按上述方法计数活细胞。

2.4.4细胞融合操作程序融合:按骨髓瘤细胞与脾细胞1∶5的比例取两种细胞。一般取约2×107个骨髓瘤细胞和108个脾细胞加入50mL尖底塑料离心管中,混匀;以1 000r/min离心10min,弃上清,倒置灭菌滤纸上吸几次管口残液,然后用手指弹击管底,使沉淀细胞团成松散状,置37℃水杯中预热;用1mL吸管取0.7mL已在37℃温箱中预热的50%PEG(pH8.0)缓缓滴入含混合细胞的离心管中,边滴边摇动(离心管不离开水面),60s内滴完,然后在水中静置90s;用20mL注射器取15mL预热的无血清培养液,在2min内向融合管内滴完。开始时慢加,1min后加快,直至滴完。再补加15mL无血清培养液,以1 000r/min离心10min,弃上清,加入40mL含20%小牛血清HAT全培养液,轻轻吹吸几次,分散细胞,用弯头滴管分装于含饲养细胞的4块96孔板中,每孔0.1mL,盖盖,用胶纸(布)固定;将培养板置37℃,5%～7% CO2温箱中培养。

选择性培养:融合后用HAT全培养液培养7d后,用HT全培养液对培养板中液体进行半量换液;融合3d后开始镜检,观察是否融合成功,不必天天镜检;融合后第3天左右,逐孔镜检,标出每孔细胞群总数。当细胞群落已超过显微镜1/2视野大时(约培养10d左右),取上清液供抗体检测。同时补加HT培养液。去掉A液后,细胞将恢复叶酸代谢途径。

2.4.5杂交瘤细胞的克隆化融合后必须对阳性孔中杂交瘤细胞进行克隆化,其原因是:融合后阳性孔中的杂交瘤细胞不一定都是目的细胞;一些杂交瘤细胞是不稳定的,可能丢失染色体,丧失产生抗体能力,需不断清除变异细胞;在液氮中长期保存的杂交瘤细胞也有丧失分泌抗体的可能。所有这些情况说明,需对杂交瘤细胞进行连续克隆化,以纯化目的细胞。

最常用的克隆化方法是有限稀释法,操作步骤如下:提前1～2d向96孔板加动物腹腔巨噬细胞,置CO2培养箱中备用,方法见细胞融合操作程序。待克隆化的阳性融合细胞,达到24孔板扩大培养后再克隆,也可边扩大边从96孔板取样直接克隆。用吸管将细胞群吹打分散,制成悬液,按前述方法精确计数活细胞数。从96孔板直接取样克隆,计数取样只用1滴悬液,用另一支滴管加无血清培养液9滴作10倍稀释,计数。用HT培养液将细胞稀释至每毫升5、30和50个细胞各40mL;每种杂交瘤细胞用一块备用的含饲养细胞的96孔板,每个稀释度32孔,每孔加细胞悬液0.1mL,每孔应含3和5个细胞。由于计数和加样的误差,往往偏高或偏低。如从96孔板直接取细胞克隆,应在克隆完后立即把孔中和稀释管中剩余细胞全部转入24孔中扩大培养,以备失败时重新克隆;在37℃5%～7%培养箱中培养7d左右,镜检,标出所有板孔的细胞群落数。按融合所述方法采样,进行抗体检测。将单克隆阳性的细胞先转入24孔,后在培养瓶中扩大培养,然后冻存。对于新融合的杂交瘤细胞,一般至少克隆2～3次。对于冻存的克隆细胞株,在复苏时,最好同时克隆化,以不断清除变异细胞,保持分泌抗体的稳定性。

2.4.6细胞的冻存和复苏

冻存液:20%小牛血清,10%二甲基亚砜(DMSO),70%基础培养液,混匀,冰浴或冰冷。

冻存方法与步骤:收集处于对数生长期的细胞,离心沉淀,按每毫升5×106～5×107个最终细胞浓度,重悬于冻存液中,按每瓶1mL,分装于2mL安瓿中,火焰封口,标上细胞名称、冻存日期,装入布袋中。将细胞置于泡沫塑料容器内,放入-70℃超低温冰箱内,次日取出,立即投入液氮罐保存。或将细胞在4℃放置1h,然后移入液氮罐口,每5min下降2cm,在液氮面上停留30min以上,再浸入液氮中。

复苏方法与步骤:从液氮中取出细胞安瓿,放入37℃水浴中,轻轻摇动,当只剩一点冰块时,即取出置冰浴上。打开安瓿,将细胞移入含10mL无血清基础培养液的尖底离心管中,轻轻摇动,离心沉淀,弃上清,用3～4mL全培养液或HT培养液重悬,移入5mL细胞培养瓶中,置37℃,5%～7%CO2温箱中培养。如镜检时死细胞较多,可向培养液中加入最终浓度为104～105个/mL的动物腹腔巨噬细胞。

2.4.8单克隆抗体的生产单抗分体内生产法和细胞培养生产法,在一般实验室条件下,体内生产法最为常用。

动物体内生产法:将0.5mL液体石蜡或降植烷注入Balb/c动物腹腔;15d后每只动物腹腔接种0.2mL计5×105个细胞,5d后每天观察动物腹部,当用手触摸时皮肤有紧张感时,即用16～18#针头采集腹水,如采2～3次,每只可采5～10mL腹水,抗体含量为1～5mg/mL;离心管去细胞和其他沉淀物,收集上清,测定效价,分装,-70℃存放。纯化前,膜滤或高速离心再次除渣。

细胞生产法:一般实验室制备单抗常用单层培养法。当细胞密度为1×105～2×106/mL时,上清中的单抗体浓度为10～50μg/mL,所以大量生产单抗必须提高细胞密度。目前用于大量生产的是悬浮培养和细胞固定化培养两大类。