材料与方法
1.1 菌种
黑曲霉（Aspergillus niger） HY-D7，由齐齐哈尔大学食品和生物工程学院生化工程实验室保藏。
1.2 培养基
1.2.1 斜面培养基（PDA） 200 g馬铃薯去皮，切块煮沸 30 min，然后用纱布过滤，再加20 g葡萄糖及20 g琼脂，后加水补足至1 000 mL，pH值自然。0.1 MPa/cm2灭菌 30 min。
1.2.2 平板分离培养基（PDA） 配制方法同“1.2.1”。
1.2.3 固体培养基 将10 g麸皮、0.25 g豆粕、0.35 g NaNO3、0.1 g（NH4）2SO4装入250 mL三角瓶内，按料液比 1 g ∶ 1.5 mL 加入pH值5.0～5.5的水。0.1 MPa/cm2灭菌30 min。
1.2.4 果胶平板培养基 0.1% K2HPO4，0.05% MgSO4，0.3% NaNO3，0.001% Fe2（SO4）3，2.0%琼脂，0.2%果胶，pH值5.5。0.1 MPa/cm2灭菌30 min。
1.3 试验方法
1.3.1 出发菌株的筛选
1.3.1.1 菌种活化 取1个斜面保藏的黑曲霉菌种，接种于PDA斜面培养基，36 ℃恒温培养5 d。
1.3.1.2 制备孢子悬液 取1支活化的斜面，加入无菌水洗下孢子，转入装有玻璃珠及无菌水的三角瓶中，振荡使孢子分散，制成均匀的孢子悬液，调整孢子浓度为106 CFU/mL。
1.3.1.3 平板分离 对菌悬液进行系列稀释，使其浓度分别为105、104、103、102 CFU/mL，并分别涂布于果胶平板培养基上，36 ℃恒温培养5～7 d。
1.3.1.4 菌株的筛选 向平皿中加入5 mL碘液，静止2 min即可见清晰的透明圈，将碘液倒出，加入5 mL生理盐水 10 min，将剩余碘液冲洗干净，选取透明圈直径与菌落直径比值大的菌株接种于斜面培养基上，并分别进行固体发酵，选取酶活性高的作为出发菌株。
1.3.2 诱变处理
1.3.2.1 微波诱变处理 取36 ℃恒温培养5 d的出发菌种斜面，用0.9%生理盐水洗下孢子，在盛有适量玻璃珠的锥形瓶内充分振荡形成单孢子悬液，调整孢子浓度为 106 CFU/mL。吸取制得的孢子悬液，注入底部平整的平皿中，每个平皿的悬液量为10 mL，将盛有单孢子悬液的平皿置于微波炉中，微波炉的功率调为700 W，脉冲频率为 2 450 Hz[6]，处理时间分别设为0、5、10、15、20、25、30、35、40 s，对孢子悬液进行微波处理。分别从各个处理时间的平皿中取出菌悬液作适当稀释，吸取0.1 mL涂布于分离平板培养基，每个浓度涂布3个平板。将平皿用黑牛皮纸包裹以避光，置于36 ℃恒温箱中倒置培养，菌落长好后（约4 d）记数。
1.3.2.2 硫酸二乙酯诱变处理 取36 ℃恒温培养5 d的筛选好的菌种斜面，转入装有玻璃珠、无菌水的三角瓶中，振荡使孢子分散，制成均匀的孢子悬液，调整孢子浓度为 106 CFU/mL。用体积分数为0.621%的硫酸二乙酯溶液对孢子悬液进行处理，在处理5、10、15、20 min后，加入0.3 mL 2.0% Na2S2O3溶液终止反应。吸取0.1 mL经不同时间硫酸二乙酯处理的菌悬液，作适当稀释并涂布于分离平板培养基上，每个浓度涂布3个平板。将平皿用黑牛皮纸包裹以避光，置于36 ℃恒温箱中倒置培养，菌落长好后（约4 d）记数。
1.3.3 致死率曲线的绘制 选择致死率为70%～80%时的处理时间作为微波及硫酸二乙酯的处理时间，相关计算公式：
1.3.4 突变株的筛选
1.3.4.1 突变株的初筛 方法同“1.3.1.4”节。
1.3.4.2 突变株复筛 将初筛所获得的菌株进行固体发酵，每株5个平行，36 ℃培养72 h后，按干基的25倍（质量体积比）分别向培养基中加入蒸馏水浸提3 h，4层纱布过滤，得粗酶液。将其适当稀释，分别测定各菌株的果胶酶活性，选取果胶酶活性高的菌株。
1.3.5 果胶酶活性的测定方法 采用3，5-二硝基水杨酸法[7]，底物为0.4%果胶溶液（pH值4.0），取0.5 mL适当稀释的酶液于比色管中，加入2 mL底物溶液，45 ℃水浴反应 30 min，加入3，5-二硝基水杨酸（DNS）溶液煮沸5 min，冷却，定容至25 mL，520 nm 处测定吸光度。酶活性定义：上述条件下1 min分解果胶生成1 μmol半乳糖醛酸所需的酶量为1个酶活性单位（U）。
1.3.6 突变株遗传稳定性的测定 将复筛获得的正突变株连续传代5代，采用固体发酵法考察菌株的产酶特性。
2 结果与分析
2.1 微波处理时间的选择
各种诱变剂有不同的剂量表示方法，剂量一般指作用强度和作用时间的乘积。微生物诱变剂的相对剂量可用相对致死率来表示。诱变剂的剂量与微生物的致死率在一定范围内成正比，即剂量越高，致死率也越高，在残存细胞中变异幅度也大；反之剂量越低，致死率也越低，在残存细胞中变异幅度也小。合适的剂量既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围。所以，合适的诱变剂剂量的选择对于微生物的诱变育种是十分必要的。在诱变育种工作中，比较倾向于较低的剂量，致死率在70%～80%之间的高产菌株诱变效果较好。从图1可以看出，黑曲霉HY-D7的微波诱变最适处理时间为15 s。
2.2 微波诱变结果
将HY-D7制成单孢子悬液经微波诱变处理15 s后，涂布于果胶平板培养基上，36 ℃培养4～5 d，用透明圈法筛选出酶活性有显著提高的突变株，部分结果见表1。
将初筛获得的正向突变株分别接种于固体发酵培养基进行进一步复筛，最后筛选出1株高产果胶酶菌株HY-E61，HY-E23的产酶活性也较高，部分结果见表2、图2、图3。
2.3 硫酸二乙酯处理时间的选择
从图4可以看出，由于致死率在70%～80%之间菌株的诱变效果好，因此黑曲霉HY-E61的硫酸二乙酯最适处理时间为15 min。
2.4 硫酸二乙酯诱变结果
首先用体积分数为0.621%的硫酸二乙酯处理黑曲霉HY-E61孢子悬液15 min，然后用2.0% Na2S2O3溶液来终止诱变处理， 再然后将诱变后的孢子悬液涂布于果胶平板培养基，36 ℃培养4～5 d，最后用透明圈法筛选出酶活性有明显提高的突变株HY-Z21、HY-Z40，部分结果见表3、图5、图6。
将初筛所得的正突变株分别接种于固体发酵培养基作进一步复筛，结果见表4，最后筛选出1株高产果胶酶的菌株HY-Z40。
2.5 遗传稳定性试验
对突变株HY-Z40进行传代培养，连续培养5代，每代菌株进行固体发酵，测定它们的酶活性。从图7可以看出，突变株HY-Z40传代5次后，果胶酶活性都较高且产酶性状稳定。
3 结论
本试验以黑曲霉HY-D7作为出发菌株，采用微波及化学试剂硫酸二乙酯作为诱变剂处理黑曲霉孢子悬液，利用透明圈法进行初筛，用固体发酵法进行复筛，最后得到高产果胶酶的突变株HY-Z40，其产果胶酶活性达2 198 U/g，是出发菌株产果胶酶活性的2.51倍。经过连续5代的斜面培养，突变菌株HY-Z40产果胶酶活性稳定。
参考文献：
[1]由 田，宋 刚，凌红志，等. 果胶酶高产菌株的紫外线及硫酸二乙酯的诱变育种[J]. 微生物学杂志，2011，31（5）：69-72.
[2]王爱峰，张智维，曹忙选. 果胶酶高产菌株的激光诱变选育研究[J]. 西北农业学报，2009，18（2）：265-268.
[3]张智维，杨 辉，陈 合. He-Ne激光诱变选育果胶酶高产菌株[J]. 食品工业科技，2006（10）：156-157.
[4]蒋红菊，杨加志，宋加妹，等. 高产果胶酶菌株选育及发酵产酶条件优化的研究进展[J]. 中国酿造，2010（11）：1-5.
[5]曾庆梅，李志强，司文攻，等. 紫外-微波复合诱变选育高产酿酒酵母菌株[J]. 微波学报，2010，26（增刊2）：329.
[6]贾红华，周 华，韦 萍. 微波诱变育种研究及应用进展[J]. 工业微生物，2003，33（2）：46-50.
[7]杜国军，王殿友，刘晓兰，等. 高产果膠酶黑曲霉的复合诱变选育[J]. 食品工业，2014，35（12）：1-4.
相关热词搜索： 诱变 菌株 果胶 选育 硫酸
