镉抗性植物内生菌EB12—6菌株的筛选及去除Cd2+的初步研究

材料与方法

1.1材料

1.1.1 供试植物

2010年9月于辽宁抚顺市李石开发区沈抚污灌区采集野生植物：东方蓼、狗尾草、稗草、山莴苣、北柴胡、大花鬼针草等，取样后于48 h内用其根茎健康组织进行植物内生菌的富集和分离。

1.1.2 培养基

分离用培养基：固体牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基。

筛选用培养基：在配制牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基的过程中分别加入CdCl2，使培养基中含Cd2+浓度分别为25， 50， 100， 150 mg/L。

1.2方法

1.2.1 内生菌菌株的分离、纯化

取所采集植株的根、茎分别用流水冲洗干净，用75%酒精浸泡1 min，无菌水冲洗3～4次，0.1%升汞浸泡5 min，无菌水冲洗3～4次。用无菌解剖剪刀或无菌手术刀将根、茎组织切成5～10 mm大小组织块，分别贴于牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基平板上，同时将最后一遍冲洗的无菌水取适量涂布平板，分别于37℃、28℃环境下培养数天，若无菌水涂布的平板无杂菌生长，则将正常处理的平板上长出的菌落按常规方法纯化后保存备用。

1.2.2 抗镉内生菌菌株的筛选

将已分离纯化的活化内生菌液按5%（V/V）接种量分别接种于含Cd2+浓度为25， 50， 100， 150 mg/L的牛肉膏蛋白胨培养液或PDA培养液中，37℃或24℃，120 r/min条件下振荡培养，将振荡培养后的培养液分别稀释到10-3， 10-4， 10-5倍涂布在含Cd2+浓度为20 mg/L的相应培养基平板上，挑取单菌落，如此反复得到抗镉内生菌菌株。将已得到的抗镉菌株接种于斜面固体培养基上，置4℃冰箱保存。

1.2.3 Cd2+去除率的测定

采用原子吸收分光光度法测定Cd2+浓度。将培养液4000 r/min离心20 min除去菌体，残留的上清液用于测定Cd2+浓度，以不含菌的含Cd2+培养液为对照[8]。

Cd2+去除率%=[（C0-C）/C0]×100%

其中为C0为Cd2+的初始浓度（mg/L），C为Cd2+的残留浓度（mg/L）。

1.2.4 抗镉内生菌EB12-6菌株的形态学观察

1.2.4.1 菌落形态

采用稀释涂布法将所分离得到的抗镉内生菌接种于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，37℃培养1～2 d，观察其菌落特征。

1.2.4.2 菌体形态

分别采用单染色法、革兰氏染色法、鞭毛染色法等对抗镉内生菌进行染色观察和描述，同时采用显微镜直接测定法测定菌体大小。

1.2.5 抗镉内生菌EB12-6菌株生长特性的测定

1.2.5.1生长曲线的测定

将抗镉内生菌接种于牛肉膏蛋白胨培养液中，置37℃，120 r/min培养，分别于0， 4， 8， 12， 24， 48， 60， 72， 84， 96 h测定OD600值，以未接菌的培养液作为对照。依据所测数据绘制生长曲线。

1.2.5.2最适培养温度的测定

将抗镉内生菌接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，分别置于12℃、25℃、37℃、45℃、50℃恒温振荡器，120 r/min，培养 36 h，测定OD600值。

1.2.5.3初始pH值对EB12-6菌株生长的影响

将牛肉膏蛋白胨培养液分别调制pH为4， 5， 5.5， 6， 6.5， 7， 7.5， 8， 8.5， 9， 10，分别接种抗镉内生菌，置于37℃，120 r/min振荡培养36 h，分别测其OD600值。

1.2.5.4不同装液量对EB12-6菌株生长的影响

将将抗镉内生菌接种于装液量为50， 75， 100， 150 mL的250 mL三角瓶中，37℃，120 r/min振荡培养36 h，分别测其OD600值。

1.2.5.5NaCl浓度对EB12-6菌株生长的影响

将抗镉内生菌接种于含NaCl浓度为0.5%， 1%， 2%， 3%， 5%， 10%的牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃，120 r/min振荡培养36 h，分别测其OD600值。

2结果与分析

2.1抗镉内生菌株的分离纯化及筛选

经组织分离法分离纯化得到46株植物内生菌，其中23株细菌、23株真菌。经用含Cd2+培养基筛选，得到6株对重金属镉具有抗性的菌株，其中4株真菌（EF12-2、EF12-4、EF12-6、EF12-9），2株细菌（EB12-6、EB12-9）。

2.2Cd2+去除率的测定

采用原子吸收分光光度法测定已筛选得到的6株内生菌的Cd2+去除效果见表1。由表1可见，2株内生细菌对Cd2+的去除效果较好，去除率均达60%以上，而4株内生真菌的Cd2+的去除作用相对较弱。根据对Cd2+的去除作用效果，最终选取内生细菌EB12-6菌株进行深入的实验研究。

2.3EB12-6菌株形态特征

EB12-6在牛肉膏蛋白胨固体培养基上的菌落特征是：菌落呈乳白色规则圆形，边缘整齐，表面光滑。EB12-6菌体呈短杆状，长度为0.9～1.25 µm，宽度为0.65～0.85 µm；无芽孢、荚膜，有鞭毛，革兰氏染色阴性。

2.4EB12-6菌株生长特性

2.4.1 EB12-6菌株生长曲线

EB12-6菌株生长曲线见图1。由图1可以看出，菌株在0～4 h处于延迟期，4～36 h为对数增长期，36～48 h为稳定期，48～96 h为衰亡期。

2.4.2 温度对EB12-6菌株生长的影响

由表2可见，温度对EB12-6菌株生长影响显著，EB0901菌株在12～45℃时均能良好生长，在10～12℃时生长迟缓，当培养温度超过37℃后，菌株的生长受到明显的抑制，在50℃以上基本不生长，生长适宜温度为25～45℃，最适生长温度为37℃。

2.4.3 初始pH对EB12-6菌株生长的影响

初始pH值对EB12-6菌株生长有明显影响，当pH值为4时，该菌株基本不生长，在pH5～10时均可生长，其中，pH值为6～8时出现生长高峰，在pH值为7.5时，生长最好。EB12-6菌株可在中性偏碱性条件下生长（见表3）。

2.4.4 不同装液量对EB12-6菌株生长的影响

不同装液量对EB12-6菌株生长有一定影响（见表4）。随着装液量的增加，菌体的增长呈下降趋势，即当装液量增加时，菌体生长所需的氧气含量减少，而氧气含量的多少影响菌体的生长，说明EB12-6为好氧菌。

2.4.5 不同NaCl浓度对EB12-6菌株生长的影响

由表5可以看出，不同NaCl浓度对EB12-6菌株的生长有较大影响，在NaCl浓度为0.5%～5%时均可生长，在0.5%～3%时生长良好，当NaCl浓度大于3%时，菌株生长速度下降，当NaCl浓度为10%时，菌体几乎不生长。由此可见，EB12-6菌株具有一定的耐盐性。

3结论与讨论

从污灌区生长的植物体内分离纯化46株植物内生菌，经用含Cd2+培养基筛选得到6株抗镉植物内生菌，其中2株内生细菌、4株内生真菌。6株内生菌的Cd2+去除率不同，内生细菌的抗镉能力较强，均达到60%以上。由此可见，在污灌区生长的植物体内存在有多种内生菌（细菌和真菌），有的内生菌对某些造成污染的因素（如重金属镉）具有抗性，有的则没有，而具有抗性的内生菌其抗性强弱也有差别。

镉抗性细菌菌株EB12-6在pH7.5，37℃，培养36 h，培养基初始Cd2+浓度为20 mg/L条件下，对Cd2+去除率达63.88%，但作为内生菌，当其侵染植物体与植物体共生联合作用时，对环境镉的去除作用效果和作用机理以及该菌株是否对其他重金属如铅、铜、镍、锌也具有一定的抗性，还有待深入研究。

生长于沈抚污灌区的野生植物对石油烃、重金属等有一定的吸收作用，具有较强的胁迫抗性，而这是否得益于其体内存在的抗胁迫内生菌，尚难确定。内生菌与植物之间的互作影响及机制已成为当今生态学、微生物学和植物生理学探究的热点问题[9-12]，深入研究和开发植物内生菌资源，利用内生菌与其宿主植物联合修复重金属污染具有重要的理论研究意义和实践应用价值。

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（责任编辑：丁志祥）