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摘要：从自然环境中，筛选出了高效降解几丁质的菌株，同时也具有广谱的杀虫潜能的菌株，为植物病虫害的防治提供一个新思路。以武汉沙湖边的水样为材料，经过富集培养、初筛和復筛后，筛选到一株高效降解几丁质的菌株，并对菌株进行生理生化和16s rDNA鉴定，同时测定了产生的几丁质酶的活力，探讨了菌的发酵液对真菌的拮抗作用和毒杀秀丽隐杆线虫作用。从水样中筛选到一株能够在pH7和pHll的1%胶体几丁质平板上有明显水解圈的菌株，经生理生化和16s rDNA鉴定，该菌为粘质沙雷氏菌，命名为MEW06。经摇瓶培养后，测得该菌株发酵上清液的几丁质酶活力可达75 U/mL。该茵能抑制苹果轮纹菌和草莓灰霉真菌的生长，并能毒杀秀丽隐杆线虫。MEW06菌株能分泌高活性的几丁质酶，该酶具有广谱的pH值作用范围，同时具有杀菌杀虫作用，因此在植物生物防治方面有很好的应用前景。
关键词：粘质沙雷氏菌;几丁质酶;筛选鉴定;应用
中图分类号：S470.18
文献标识码：A
文章编号：1674-9944（2018）12-0164-05
1 引言
几丁质在自然界的储量丰富，仅仅次于纤维素，其降解产物几丁寡糖的生理生化功能越来越引起人们的注意。但是工业上制备几丁寡糖步骤多，成本高。因此，使用几丁质酶来生物降解几丁质生产几丁寡糖是一条切实可行的途径。另一方面，几丁质是昆虫的围食膜、植物病原线虫卵壳和植物真菌细胞壁的重要组成部分，其主要是作为支撑身体结构的骨架，对机体起到保护作用。几丁质酶在植物病虫害防治方面有着广阔的应用前景[1，2]。
以武汉沙湖周边的水样为材料，采用在几丁质培养基上进行富集培养、初筛和复筛，得到高产几丁质酶的菌株，经过生理生化和16S rDNA鉴定，确定该菌为粘质沙雷氏菌，并将该菌用于拮抗植物病原真菌和毒杀秀丽隐杆线虫实验，为进一步研究高产几丁质酶的粘质沙雷氏菌的应用提供理论指导。
2 材料与方法
2.1 菌株与试剂
水样：采集于武汉沙湖周边的水样。细粉几丁质、N一乙酰- D-氨基葡萄糖（D- GlcNAc）购于上海Sigma公司。考马斯亮蓝G-250、牛血清血蛋白（BSA）、β一巯基乙醇和胆固醇购于武汉柏维诺生物科技有限公司。
PCR引物由北京擎科生物有限公司合成，TaqDNA聚合酶购自大连TaKaRa公司。
2.2 培养基的配制
LB培养基：NaCl 10.0 g、胰蛋白胨10.0 g和酵母提取物5.0 g，去离子水溶解定容至1000 mL，pH值7.0～7.2富集培养基：细粉几丁质10 g、蛋白胨10 g、K2 HP04 0.7 g、KH2P04 0.3 g、MgS04·7H20 0.5 g、FeSO4.7H20 0.01 g和ZnS04 0.01 g，去离子水定容至1000 mL，pH值6.8。
初筛培养基：细粉几丁质10 g、蛋白胨10 g、K2 HP04 0.7 g、KH2P04 0.3 g、MgS04·7H20 0.5 g、FeSO4.7H20 0.01 g和ZnS04 0.01 g，去离子水溶解定容至1000 mL，pH值6.8。
几丁质平板培养基：胶体几丁质10 g、蛋白胨10 g、K2 HP04 0.7 g、KHZP04 0.3 g、MgS04·7H20 0.5 g、FeS04·7H20 0.01 g、ZnSO40.01 g和琼脂15.0 g，去离子水定容至1000 mL，pH值6.8。
PDA（ Potato Dextrose Agar）培养基：马铃薯（去皮）200.0 g和葡萄糖20.0 g，去离子水溶解定容至1000mL，自然pH，用于供试真菌的培养。
线虫固体培养基（NGM培养基）：称取蛋白胨2.5g、氯化钠3.0 g和琼脂粉17.0 g，用去离子水溶解定容至975 mL，121℃高压灭菌20 min，当溶液温度降至55℃左右时，加入1 mL l M CaCl2、1 mL l M MgS04、1mL 5 mg/mL胆固醇（用无水乙醇溶解）和25 mL l M磷酸钾缓冲液（KH2 P04 108.3 g和K2 HP04 35.6 g，去离子水溶解定容至1000 mL）。
2.3 PCR引物
菌鉴定所用的引物有27F和1492F，它们的序列分别为5" - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3"、5" -TACGGCTACCTTGTTACGACT T- 3"。
2.4 实验方法
2.4.1 产几丁质酶菌株的筛选及其鉴定
（1）产几丁质酶菌株的筛选方法。富集培养初筛：将水样按照2%的接种量接种于富集培养基中，于30℃，150 r/min培养3d，再采用稀释涂平板法，将菌液涂布在LB平板上，观察菌的生长情况。
几丁质平板复筛：挑取上述生长良好的菌落，分别接种于初筛培养中，30℃，培养ld，再将菌液点样在几丁质平板上，于30℃，倒置培养3d。观察形成的水解圈情况，并用游标卡尺量取菌落的水解圈D2与菌落直径Dl比，即R（D2/Dl）。
（2）菌种的鉴定。常规染色鉴定：芽孢染色、鞭毛染色、荚膜染色和革兰氏染色参照《伯杰氏细菌鉴定手册》。
16S rDNA测序鉴定：设计16S rDNA测序特异性引物，引物名称：27F，1492R，扩增16S全序列。经过PCR产物纯化，再送到武汉博洪生物科技有限公司基于第二代高通量测序平台Illumina Hiseq2000进行基因组框架图测序，然后将测序结果在NCBI Blast数据库中进行同源性比对，采用MEGA6法作出进化树[3，4]。
2.4.2 几丁质酶活力的测定方法
（1） N-乙酰- D-葡萄糖胺标准曲线的绘制[5]。将N-乙酰- D-氨基葡萄糖（NAG）标准液、蒸馏水和二硝基水杨酸（ DNS）试剂依次加入带塞的试管，配制成不同含量的N-乙酰- D-氨基葡萄糖反應液。混匀后，沸水浴10 min。充分冷却后，以O号管为对照调零，在535 nm测定吸光度值。每个试管重复3次。将3组数据取平均值，绘制成标准曲线，见图1。线性方程为y=- 0.0249+0.153X（线性相关系数R2=0.9940）。
几丁质酶酶活的定义为：一个单位的几丁质酶酶活定义为37℃下1h产生1 μmol NAG所需几丁质酶的酶量。
（2）发酵上清液几丁质酶活力的测定方法。采用3，5一二硝基水杨酸（DNS）法测定。挑取水解圈比较大的菌落，接种到初筛培养基中，于30℃，150 rpm培养3d后，4℃，10000 r/min离心收集菌液上清液，将上清液做如下处理：取1mL上清液沸水浴15 min，作为第1组（注意密封，防止溶液体积明显减少）;另取1mL不做其他处理，作为第2组。吸取1mL的第1组发酵上清液，加入500 μL配置好的2%胶体几丁质（pH≈6.0），500 μL PBS缓冲液（PBS终浓度为50 mM，pH 7.2～7.4）。空白对照用第2组发酵上清液替换第1组发酵上清液。混合均匀后，37℃水浴反应1 h。12000 r/min离心5 min。分别取上清1 mL加入相同体积的DNS溶液沸水浴10 min。稀释10倍后，测定稀释液在535 nm处的吸光值。对照NAG标准曲线，求出几丁质酶的活性[6]。
菌株发酵上清液的酶活力（E）一第2组发酵上清液酶活力（E2） -第1组发酵上清液酶活力（El）。
2.4.3 抑真菌实验
取直径为5 mm的生长旺盛的草莓灰霉和苹果轮纹菌菌块接种于PDA平板的中央，28℃培养2d。在距离菌丝边缘2 cm的位置放置灭过菌的滤纸片（D=6mm），将lOOμL的菌液、发酵上清液（过滤除菌）、发酵上清液（高温灭活）和PBS（空白对照）分别滴在滤纸片上。28℃继续培养2d后，观察测试样品对真菌菌丝生长的抑制情况[7]。
2.4.4 线虫生测实验
秀丽隐杆线虫生测实验：将NGM固体培养基上培养得到同步化的L4期的幼虫使用灭菌的M9 buffer洗下悬浮，并清洗3次最终控制线虫浓度为40条/5 μL。向96孔板的孔中加100 μL测试样品，5μL 10 mMFUdR（抑制线虫产卵），5μL用M9缓冲液悬浮的L4期幼虫，40 μL用M9 buffer悬浮的OD600nm值为0.6的E.coli OP50，50 μL M9 buffer。每个样做3个重复，于25℃，培养3d。在体式显微镜下观察用针触法观察线虫的存活情况，并统计线虫死亡数[8]。
鉴定线虫死亡的方法：用2%的氯化钠溶液处理2min左右，死虫僵直不动，活虫卷曲或扭动。
3 结果与分析
3.1 产几丁质酶菌株的筛选及鉴定
3.1.1 产几丁质酶菌株初筛和复筛
将采集于武汉沙湖的水样经过摇瓶富集培养，以及1%胶体几丁质平板初筛实验后，筛选到4株菌在pH7和pHll的1%几丁质初筛平板上良好生长，菌落生长形态如图2所示。其中，MEW05的菌落呈白色、表面光滑，边缘整齐;MEW06的菌落呈鲜红色、表面光滑，边缘整齐;MET14的菌落呈白色、表面光滑，边缘整齐;MEW32的菌落呈白色、表面光滑，边缘整齐。
上述几株菌的发酵液分别点在pH7和pHll的胶体几丁质平板上，其水解圈如图3所示。
由图3可知，MEW05 （b）、MEW06 （c）、MET14（e）和MET32（h），4株菌在pH7和pHll的1%胶体几丁质平板上生长良好，形成明显的水解圈。它们的水解圈直径和菌落直径比R见表1。由表1可知，每株菌在pHll胶体几丁质平板上的水解圈均高于在pH7的水解圈。最大水解圈的菌株是MEW06。
3.1.2 4株菌产几丁质酶活力测定
在pHll条件下，将上述4株菌分别接种在基础培养基中培养，取上清液分别测得几丁质酶的活力（ U/mL）由大到小依次为：MEW06（ 71.74±4.36）>MEW05 （70.77±5.55）>MET32 （46.36±6.87）>MET14（38.91±2.55）。因此，选择选择MEW06菌株作为进一步筛选鉴定的材料。
3.1.3 MEW06菌株的生理生化鉴定和16S rDNA鉴定
将MEW06单菌落接种到LB培养基中，分别于28℃、37℃，150 r/min摇床培养24 h，生长情况如图4所示。在28℃呈现鲜红色，37℃不呈现鲜红色。MEW06菌经过生理生化鉴定结果为：菌株无芽孢产生、周生鞭毛、无荚膜、革兰氏阴性（图5）。
MEW06菌液进行16S rDNA序列扩增，扩增产物琼脂糖电泳如图6所示，泳道1中可见大约1500 bp的单一条带，将扩增产物送样测序，得到了1401 bp的核苷酸序列，将序列跟NCBI Blast进行同源比对分析，结果见图7A，做出的进化树图见图7B。由图7B可知，MEW06 16S rDNA序列在进化上和粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）与嗜线虫沙雷氏菌（Serratia nem-atodiphila）相近。但根据该菌的生理生化特征，鉴定MEW06为一株粘质沙雷氏菌。
3.2 抑真菌实验
MEW06发酵液及发酵上清液拮抗苹果轮纹菌FB016和草莓灰霉FB009真菌结果见图8。由图可知，MEW06菌液可以明显抑制两种真菌菌丝的生长。
3.3 线虫生测实验
MEW06的发酵液对秀丽隐杆线虫的生测实验如图9所示。由图可知，随着稀释倍数增加，MEW06发酵液对秀丽隐杆线虫的致死率逐渐下降。当稀释倍数小于8倍时，秀丽隐杆线虫的致死率均为100%。当稀释倍数为12倍时，致死率仍然超过半致死率。
4 讨论
从武汉沙湖周边的废水中，筛选到一株产红色素的菌，而且其发酵液及上清液均能高效降解胶体几丁质，说明该菌能产生胞外幾丁质酶，后经生理生化和16srDNA鉴定，可以判断该菌为粘质沙雷氏菌。产几丁质酶的活力超过75 U/mL，但是产酶的条件优化、酶学性质特点以及MEW06基因组数据分析等，有待进一步研究。
在MEW06抗真菌生测实验中，植物病源真菌的细胞壁，特别是菌丝部分存在大量的几丁质[9]，而MEW06菌培养时，分泌几丁质酶能够水解胶体几丁质平板，因此，MEW06发酵液可以明显抑制植物致病真菌草莓灰霉和苹果轮纹菌丝的生长。在MEW06线虫生测实验中，由于秀丽隐杆线虫的口器、子宫和卵壳分布着大量的几丁质，因此MEW06发酵液分泌的几丁质酶也可以杀灭秀丽隐杆线虫。
综上所述，MEW06菌株可以抑制植物病源真菌菌丝的生长，能够有效杀灭秀丽隐杆线虫，此外，几丁质也存在于棉铃虫等鞘翅目昆虫的围食膜中[10]，因此，MEW06菌株有望在植物生物防治方面有很好的应用前景。
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