AFLP分子标记的发展及应用

摘 要:扩增片段长度多态性(AFLP) 是一种高效的DNA分子标记技术, 近年来其研究方法和检测技术不断改进和优化,并由此衍生出多种相关技术, 使其在遗传多样性、种质鉴定、遗传图谱构建、基因定位等研究中得到广泛的应用。本文即对AFLP的原理、衍生技术及其应用等进行了介绍。

关键词:分子标记技术;AFLP;应用

中图分类号:Q503 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2010)05-0010-05

分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段,直接体现基因组DNA 间的差异。在过去30多年,DNA 分子标记得到了迅速发展。扩增片段长度多态性 (Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP) 技术为第二代分子标记技术,是在随机扩增多态性 (Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD) 和限制性片段长度多态性 (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) 技术上发展起来的DNA 多态性检测技术,同时拥有RFLP的高重复性和RAPD简便快捷的特点。同其他以PCR 为基础的标记技术相比,AFLP 技术能同时检测到大量的位点和多态性标记,具有覆盖面广、高保真性、高效性、高分辨率、DNA用量少、事先勿需知道序列任何信息、可在全基因组产生标记、标记的分离遵循孟德尔遗传规律等优点,自1995年由Zabeau和Vos[1]创建以来,已在动物、植物和微生物的分子系统学研究中得到应用,具有广阔的发展前景。

1 AFLP 标记的基本原理、操作流程及技术关键

1.1 AFLP 标记的原理

AFLP 标记的原理是对基因组总DNA 酶切后经PCR 进行选择性扩增。先将基因组DNA 用两种限制性内切酶酶切成大小不等的片段,并与含有粘性末端的人工接头相连,形成酶切位点不同的限制性酶切片段,然后用与接头和位点相匹配的引物进行预扩增,预扩增产物作为进一步PCR 扩增的模板,再选用特异引物进行选择性扩增,扩增后的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳将特异的限制性片段分离。由于不同来源DNA 的酶切片段存在差异,因而产生了扩增产物的多态性[2]。

1.2 操作流程

AFLP 标记的具体操作流程[3]为: ①DNA 提取和质量检测;②双酶切和酶切片段连接;③酶切连接片段的预扩增;④选择性扩增; ⑤扩增产物在聚丙烯酰胺变性凝胶上电泳; ⑥将电泳后的凝胶进行显影检测及数据分析。

1.3 技术关键

1.3.1 保证模板DNA 的质量 在制备DNA 的过程中要特别注意避免核酸酶及各种失活物质的污染,基因组DNA OD260/OD280的值应为1.8左右。

1.3.2 酶切和酶切片段连接中掌握最适时间 时间过长、过短均影响酶切和连接的效果,找到最适时间,既可使酶切和连接彻底,又可提高工作效率。另外,在某些体系中可将酶切和连接两步合为一步进行,以简化反应步骤、缩短反应时间[4,5]。

1.3.3 引物、接头的合成及引物的巧妙组合 人工设计合成的通用接头以及与接头序列相匹配的专用引物,使得在事先不知道基因组序列信息的条件下即可进行扩增反应。这个特点使引物之间的搭配存在很大的灵活性,因此引物的正确筛选与巧妙组合显得十分重要。若引物搭配的恰到好处,仅用少数几对引物就可获得大量的遗传信息,既能提高工作效率,又能节约开支[6]。

1.3.4 优化反应条件 AFLP 分析对PCR 反应条件要求较高,Mg2+、dNTP 的浓度、Taq 酶量及预扩产物稀释倍数等条件对反应结果的影响尤为显著,需反复摸索确定最适扩增条件[5,6]。

2 AFLP的衍生技术

AFLP 标记技术自诞生以来在限制性内切酶组合、引物设计、检测方法等方面有了较大改进,并发展衍生了许多相关技术。

2.1 单内切酶扩增片段长度多态性技术 (Selective Amplified DNA Fragments, SADF)

SADF 技术采用单限制性酶对基因组DNA 或cDNA 进行消化,并且使酶切和连接在同一反应体系中进行,选择性扩增产物在琼脂糖凝胶电泳后即可进行分离检测[7]。对于基因组相对简单的生物,利用单限制性酶进行酶切不仅快速而且重复性好,但对于基因组复杂的生物,由于琼脂糖凝胶的分辨率较低,往往受到一定的限制。

2.2 三内切酶扩增片段长度多态性技术 (Three Endonuclease Amplified Fragment Length Polymorphism, TE-AFLP)

TE-AFLP 技术应用三种限制性内切酶(两种低频剪切酶和一种高频剪切酶)和两组接头在单一的缓冲体系中对基因组DNA酶切和连接来研究DNA片段多态性。这种方法与传统的双酶切AFLP技术相比分辨率更高,带谱的数目减少且分布均匀,特别适用于复杂基因组的多态性条带鉴定和分离及自动荧光标记序列的研究[8]。

2.3 直接扩增长度多态性技术 (Direct Amplification of Length Polymorphism, DALP)

DALP 技术不需要酶切、连接等步骤,扩增使用M13测序通用引物,只是正向引物的5′端共有M13序列,3′端加2～4 个核苷酸的选择序列;反向引物是M13测序引物,扩增也是分两步,第2次扩增与第1次使用的引物不同。DALP的产物可以直接测序,通过比较扩增产物的有无、片段大小来研究动物的进化[9]。

2.4 序列相关扩增多态性技术 (Sequence Related Amplified Polymorphism, SRAP)

SRAP技术通过独特的正向引物和反向引物设计,优先扩增基因组内的开放阅读框(ORFs)。引物分别与外显子和启动子(或内含子) 区域配对,因不同物种、不同个体的内含子、启动子和间隔区的长度不等而产生多态性[10]。 SRAP具有简便、稳定、中等产率、便于克隆测序等特点,同时它针对基因组的编码区扩增,可产生一定数量的共显性标记。

2.5 选择性扩增多态微卫星位点技术 (Selective Amplification of Microsatellite Polymorphic Loci, SAMPL)

SAMPL 利用微卫星序列设计引物,不需要预先对微卫星位点进行克隆、测序等研究。在AFLP扩增时,将一个具有3 个选择碱基的AFLP 引物与一个16～18 bp人工设计的SAMPL 引物组合在一起,这个SAMPL引物含有混合微卫星序列,并用放射性同位素标记。放射性标记的SAMPL引物与复合微卫星的连接区域序列互补,因此可以在不知道微卫星侧翼序列的情况下扩增模板DNA中的微卫星位点, 扩增的片段是从SAMPL 引物到AFLP 引物之间的片段, 此片段中含有微卫星序列。由于SAMPL 技术可以扩增微卫星位点,从而增加了共显性标记的比例[11]。

2.6 互补DNA扩增片段长度多态性技术 (cDNA-Amplified Fragment Length Polymorphism, cDNA-AFLP)

cDNA-AFLP 是将AFLP 技术应用于mRNA 表达差异分析的一种mRNA指纹图谱技术[12]。基本原理是将分离纯化的mRNA反转录成cDNA 第一链,再以第一链为模板合成双链cDNA,然后以此双链cDNA为模板进行酶切连接、预扩和选扩,最后找到差异表达的片段。利用cDNA-AFLP进行表达基因研究对于定位基因、明确基因功能更具意义。该技术重复性好,假阳性低,可检测低丰度表达的mRNA,准确反映基因间表达量的差别,并全面获取转录组的表达信息。自从其诞生以来,许多研究者将此法用于基因的差异表达谱分析以及差异表达基因的克隆,但该法的主要局限性在于不易分离到全长序列。

2.7 荧光扩增片段长度多态性技术 (Fluorescent Amplified Fragment Length Polymorphism, FAFLP)

FAFLP 用荧光染料代替放射性同位素来标记引物,从而得到荧光染料标记的片段,用自动化测序仪进行片段的检测。该方法较传统方法可获得更多的信息,是AFLP技术的一大进步,现已广泛应用于动植物和微生物等的遗传变异、分子病理学及标记图谱等的研究[13]。

除了以上的衍生技术,AFLP指纹图谱库的建立、相关数据包的开发和自动化及AFLP精密分析仪器的使用都极大地促进了本来功能就比较强大的AFLP指纹技术的广泛应用。AFLP 标记技术最明显的不足之处是绝大部分表现为显性标记,共显性标记频率较低,这会使很多遗传信息丢失,无法估计等位基因频率,直接影响构建标记遗传图或数量性状基因图以及标记辅助选择的效率和精度,因此将AFLP显性标记转化为共显性标记的正态分布混合模型[14]、AFLP 与单链构象多态性 (Single-Strand Conformation Polymorphism,SSCP) 相结合[15]、利用详细的系谱资料信息分析[16]等一系列方法得到深入开展。同时AFLP 标记向位点特异性标记序列,例如特征化扩增区(Sequence Characterized Amplifiedre-Regions,SCAR)[17]或酶切扩增多态性序列(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence,CAPS)[18]的转化促使大规模单位点检测、标记辅助选择和图位克隆快速高效进行。总之,对AFLP技术的不断优化和完善,使其由相对低通量和信息不完全技术转化为高通量、信息完全的分子标记技术,不仅能区分纯合子和杂合子,还能够将感兴趣的AFLP条带进行位点特异性标记的高效转化,从而有利于进行大规模单位点检测和基因克隆,检测技术更趋高效[19]。

3 AFLP的应用

AFLP技术最初是用于对植物基因组的分析,随着技术的不断改进和完善,目前,被广泛应用于群体遗传结构、遗传多样性、种质鉴定、构建遗传图谱、基因定位等多个方面。

3.1 遗传图谱构建

遗传图谱的构建是遗传学研究的一个重要领域,可为基因定位、图位克隆、标记辅助育种、基因组结构和功能等研究打下基础。实践证明,AFLP多态性产物定位于图谱上的比例相当高,很适用于构建遗传图谱。齐靖等(2009)[20]以冬枣×临猗梨枣杂交F1代为作图群体,利用AFLP标记和RAPD标记,对已有的枣遗传连锁图谱进行加密,构建了1张包含388个AFLP标记和35个RAPD标记、由15个连锁群组成的高密度枣遗传连锁图谱,覆盖基因组总长度130 914 cM,标记间平均距离311 cM,结果表明AFLP多态性检出效率明显高于RAPD,进一步验证了AFLP是一种多态性丰富、高通量的分子标记类型,对于构建图谱和增加图谱密度是高效的。蔡长春等(2009) [21]用 112 个 AFLP、6 个 SRAP标记构建了白肋烟的分子标记遗传连锁图谱。高丽霞等(2009) [22]利用白姜花×圆瓣姜花的F1 群体,分别构建了父母本的基于SRAP标记的连锁图谱,其中母本的有18个连锁群,包含139个标记,覆盖了917.1 cM,标记平均间距为8.6 cM;父本的连锁图有23个连锁群,包含203个标记,覆盖了1 386.8 cM,标记平均间距为8.0 cM。从父母本包含的标记数量及覆盖的遗传距离得出,父本可能有更高的杂合性,野生环境比起栽培条件可能更容易诱导基因的变异。岳志芹等(2004)[23]和李健等(2008)[24]也分别利用AFLP技术对中国对虾遗传连锁图谱的构建进行了研究,构建了中国对虾雌、雄性的遗传连锁图谱。此外,喻达辉等(2007)[25]利用AFLP标记构建了印度合浦珠母贝全同胞家系的遗传图谱。目前,许多生物的遗传连锁图谱都是采用AFLP技术加以构建的。

3.2 遗传多样性与种质资源鉴定

AFLP被广泛应用在那些无法通过形态特征加以区别的家系或近缘物种的系统发生关系的研究中,并且不受组织和器官种类、发育阶段、生境条件等诸多因素的影响,是遗传多样性调查、种质鉴定、种质分类及种质亲缘关系研究的理想标记。张东等(2009)[26]利用1对引物对30株青岛近海野生裙带菜孢子体种群内遗传多样性进行了AFLP分析,扩增出38条清晰可重复的带,其中32条呈现多态性,多态位点比例为84.21%,根据引物扩增的指纹图谱,计算得出野生种群内个体间各项遗传指数水平均较高,种群内遗传变异丰富,并通过聚类分析将30个个体划分为2大类群。车卓等(2009)[27]利用SRAP 分子标记技术对中国芝麻核心收集品的育成品种(系)进行遗传多样性分析,结果表明育成品种(系)的遗传基础存在一定的多样性,但遗传相似系数较大(0.5342～0.9688),遗传距离较近,由此提出了在芝麻育种的亲本选配中应积极引入地方种质、国外种质等,以拓宽遗传基础。汤洪敏等(2007)[28]应用DALP 技术对云南野生大白口蘑遗传多样性进行分析,结果表明大白口蘑遗传变异有95.56%存在菌塘间,4.44%存在菌塘内,即大白口蘑遗传变异绝大多数存在于菌塘之间。周遵春等(2007)[29]利用AFLP 对中间球海胆、光棘球海胆及其杂交F1 代群体遗传多样性进行了分析,结果表明群体内的遗传多样性比较丰富,尽管杂交海胆在表型上可以明显分成两种类型,但是通过AFLP 统计的遗传距离进行的个体聚类却随机聚在一起,不能分成两个群体。在鱼类的研究方面,徐冬冬等(2008)[30]应用AFLP 技术对条斑星鲽、星斑川鲽及漠斑牙鲆的养殖群体进行遗传分析,结果表明,条斑星鲽和星斑川鲽养殖群体的遗传变异水平相对较低,而漠斑牙鲆的遗传变异水平相对较高。

3.3 基因定位与表达调控研究

AFLP 技术具有强有力的多态性检出能力,通过比较种群内和种群间的AFLP 指纹差异,可集中显示基因组表达序列的多态性差异,并进行基因的快速定位。Cui 等(2006)[31]运用cDNA-AFLP 技术对红鳍东方鲀成熟和未成熟个体的逆转录DNA 进行检测,发现了5个性别标记;其中前4个(TDF1～4)来自性腺,第5个(TDF5)来自尾鳍,因此,TDF5 就可以用于快速鉴定红鳍东方鲀性别,不必对鱼进行解剖。刘平武等(2007)[32]以甘蓝型油菜不育系1141、恢复系花叶恢及其杂交组合F2群体为材料,利用RAPD、SSR、AFLP等技术进行恢复基因Rfp定位,找到2个与Rfp基因紧密连锁的分子标记,这两个标记分别是AFLP和RAPD,其中AFLP标记与Rfp遗传图距最近。陈迪文等(2009)[33]以白肋烟抗黑胫病品种B37和感黑胫病品种B67杂交的F1代的双单倍体遗传群体为材料,利用AFLP 和SRAP 分子标记技术构建了白肋烟遗传连锁图,在4个连锁群上共检测到7个黑胫病抗性相关的QTL。张驰等(2009)[34]用SRAP 标记进行黄瓜果刺形成基因定位,利用16 条正向引物和22条反向引物进行多态性筛选,找到2个与有毛性状(Gl) 基因连锁的显性标记,均位于Gl 位点同一侧,与Gl的连锁距离分别为3.6 cM 和12.9 cM。刘丽等(2009)[35]采用cDNA-AFLP技术分析纹枯病菌AG1-IA诱导玉米高耐纹枯病自交系R15的基因差异表达谱,获得18 条TDFs,经BLASTn比对找到其中同源序列的有13个,按其功能可分为信号传导( 2个)、抗病与防御基因( 2个)、转录调控(2个)、能量代谢(2个)等。

4 结束语

AFLP 标记技术自诞生以来,由于集成高效性、高通量、无需知道序列信息等诸多优点而在分子生物学研究中得以广泛应用。近年来,研究人员对该技术进行了不断的优化和完善,并由此衍生出多种相关技术,不仅适用于对序列未知或知之较少的生物类型,而且对序列已知的生物可进行大规模表达分析和信号传导关键组分的筛选,尤其在生物多样性研究、种属特异性鉴定、表达谱分析、精细作图、基因克隆等方面具有其它标记技术无可比拟的优势。

参 考 文 献:

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