摘 要 以海南粗榧（Cephalotaxus mannii Hk. f.）的枝条、叶为外植体进行愈伤组织诱导，采用升汞、次氯酸钠与臭氧为消毒剂，探讨不同灭菌方法对海南粗榧外植体污染和细胞活性的影响。结果表明，以升汞与臭氧复合处理的灭菌方法最佳，最佳灭菌条件为：75%酒精灭菌1 min，臭氧灭菌30 min，再用0.1% HgCl2溶液灭菌10 min。在此条件下，外植体污染率5%，愈伤组织诱导率95%，外植体细胞活力比对照提高38%。
关键词 海南粗榧；臭氧灭菌；细胞活力；污染率
中图分类号 Q942.6 文献标识码 A
Explants Sterilization Conditions of Cephalotaxus mannii Hk. f.
WANG Chengtao，ZHONG Qiuping，LI Yongcheng*
Food College， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
Abstract The branches and leaves of Cephalotaxus mannii Hk. f. were used as the explants for callus induction. In addition， mercuric chloride， sodium hypochlorite and ozone were used as the disinfectants. The impact of different sterilization methods on contamination rate and cell activity of explants was studied in the paper. The results were as follows： The combinative sterilization of mercuric chloride and ozone showed the best effect. Sterilization conditions were as follows： 75% alcohol for 1 min， ozone for 30 min and 0.1% HgCl2 solution for 10 min. It resulted in 5% of contamination rate of explants and 95% of callus induction rate， enhanced 38% of cell activity than the control under the sterilization conditions indicated as above.
Key words Cephalotaxus mannii Hk. f.；Ozone sterilization；Cell activity；Contamination rate
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.018
海南粗榧（C. mannii Hk. f.）是三尖杉科植物中分布最南的一种，是海南的特有植物。其中的抗癌活性成分三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、脱氧三尖杉酯碱和异三尖杉酯碱4种具有抗癌作用的粗榧碱在所有的三尖杉科三尖杉属植物中含量最高，因此受到人们的广泛关注[1]。海南粗榧人工繁殖很困难，且生长速度缓慢[2]。因此，采用组织培养合成这些抗癌生物碱是解决其药源植物可持续发展的有效技术手段。张伟等[3]对三尖杉（C. fortunei）悬浮细胞培养生产生物碱进行了研究。在海南粗榧（C. mannii）的组织培养中， 符文英等[4]利用温室苗作为外植体诱导愈伤组织获得成功，刘进平[5]在利用野生海南粗榧诱导愈伤组织的过程中均出现严重污染，并指出野生海南粗榧污染严重，较难获得愈伤组织。
外植体消毒灭菌，要求灭菌彻底，同时要求尽量减低对外植体细胞的伤害[6]。由于常年高温多雨，空气湿度大，热带、南亚热带生长的植物茎叶表面容易附生或共生各种微生物，它们可侵入植物表皮内的薄壁组织，很难被清除而随植物材料进入培养基中，引起组培中内生菌污染[7-8]。朱广廉[9]在热带植物相思树外植体灭菌中采用杀菌剂苯菌灵、链霉素与升汞复合处理，取得了良好效果。在一定浓度下， 臭氧可迅速杀灭细菌、芽胞、病毒、真菌及其孢子等[10]，臭氧在水中的杀菌速度比氯快[11]，由于其安全方便、环保、消毒效果好、时间短等特点， 被制药工业企业广泛应用。为解决海南粗榧组织培养中外植体内生菌的污染问题，本研究采用臭氧来杀灭植物内生菌，以期获得较好的灭菌效果，为建立海南粗榧离体培养技术体系奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
海南粗榧（C.mannii）外植体采自海南省儋州市热带植物园、霸王岭国家自然保护区和尖峰岭国家自然保护区。愈伤组织诱导培养基：MS+NAA 1 mg/L+6-BA 0.1 mg/L+2，4-D 2 mg/L+蔗糖30 g/L +卡拉胶6 g/L[4]。
1.2 方法
1.2.1 外植体的灭菌 外植体预处理，洗洁精液清洗15 min，流水冲洗30 min，然后用75%酒精灭菌1 min。
常规升汞灭菌法：选取海南粗榧嫩叶，经预处理后用0.1%HgCl2溶液分别灭菌10、14、17、20 min，接种到诱导培养基中培养观察，并统计污染率与诱导率。
升汞和次氯酸钠复合灭菌法[12]： 选取海南粗榧嫩叶做外植体，经过预处理后，用5%次氯酸钠溶液（有效氯）灭菌15 min，再用0.1% HgCl2溶液分别灭菌10、14、17、20 min，接种到诱导培养基中培养观察，统计污染率与诱导率。
升汞和臭氧复合灭菌法：选取海南粗榧嫩叶做外植体，经过预处理后放入三角瓶并用无菌水浸泡，通入臭氧灭菌30 min，再用0.1% HgCl2溶液分别灭菌10、14、17、20 min，接种到诱导培养基中培养观察，统计污染率与诱导率。
杀菌剂和抗生素复合灭菌法[13-15]：选取海南粗榧嫩叶，将其放入1 ∶ 200新洁尔灭稀释液中磁力搅拌15 min[16]，75%酒精灭菌1 min，转入到0.2%苯菌灵+0.2%链霉素+0.02%柠檬酸溶液中，于25 ℃，100 r/min摇床上震荡16 h，然后用0.1% HgCl2溶液分别灭菌10、14、17、20 min。
1.2.2 植物细胞活力检测方法 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）法[17]：剪碎100 mg海南粗榧嫩叶于试管中，加入3 mL TCC溶液（0.5 g TTC溶于100 mL，0.05 mol/L， pH 7.5的磷酸缓冲液中），在25 ℃下反应12 h。离心弃TTC溶液并收集植物材料，用蒸馏水清洗3次，加入3 mL 95%酒精后60 ℃恒温水浴10 min，抽提植物材料中酶反应生成的红色物质，离心弃植物材料，冷却，在492 nm处测吸光值。细胞活力单位以每克外植体（Fresh weight， FW）在492 nm处的吸光值表示（OD/g）。
植物细胞活力以相对活力表示，以未做灭菌处理的嫩叶为对照，其相对活力定义为1，外植体细胞相对活力=灭菌后外植体细胞活力/对照嫩叶细胞活力。
1.2.3 外植体的培养 外植体通过以上方法灭菌后，用200 mL去离子无菌水摇床清洗5次，每次10 min，然后用无菌滤纸吸干其表面水分，切为1.5 cm左右，然后接种到培养基中，每瓶2个外植体，27 ℃暗培养。每个处理接10瓶，每个处理重复3次，计算污染率、诱导率。
1.3 数据分析
2 结果与分析
2.1 常规升汞灭菌对海南粗榧外植体污染与愈伤组织诱导的影响
由表1可知，污染率随升汞灭菌时间的延长降低的；愈伤组织诱导率随着升汞灭菌时间的增加而降低。说明灭菌时间对污染与愈伤组织诱导均有明显影响；HgCl2对杂菌与植物细胞均有杀灭作用，过长的灭菌时间，同时也杀灭植物细胞。因而，17 min是一个较优的灭菌时间。
2.2 升汞和次氯酸钠复合灭菌法对海南粗榧外植体污染与愈伤组织诱导的影响
由表2可知，次氯酸钠灭菌15 min后，HgCl2灭菌时间在14 min以上时，污染率为0；愈伤组织在HgCl2灭菌10 min的诱导率为60%，但在后续培养，出现部分外植体褐变死亡的现象，随着灭菌时间的延长，外植体全部褐变死亡，说明次氯酸钠对植物组织有较大的损害作用。
2.3 升汞和臭氧复合灭菌对海南粗榧外植体污染与愈伤组织诱导的影响
由表3可知，臭氧灭菌30 min后，升汞灭菌10 min时，污染率只有5%，在14 min以上时，污染率均为0；升汞灭菌10 min诱导率为95%，与其它灭菌时间有明显差异。升汞灭菌10 min，10 d后外植体即出现局部膨大现象。灭菌时间>14 min时，外植体并没有全部死亡，均能成功诱导出愈伤组织，说明臭氧既能起到良好的杀菌作用，能减少升汞的灭菌时间从而降低其对外植体的损害。升汞灭菌10 min，虽然有少量的污染（污染率5%），但其愈伤组织诱导率最高（95%），愈伤组织后续生长良好。所以0.1% HgCl2和臭氧复合灭菌为最佳灭菌组合，最优灭菌条件为臭氧灭菌30 min，0.1%HgCl2溶液灭菌10 min，获得的愈伤组织呈淡黄色，质地松散（图1）。
2.4 杀菌剂和抗生素复合灭菌法对海南粗榧外植体污染与愈伤组织诱导的影响
由表4可知，杀菌剂和抗生素复合灭菌法对植物组织有较大伤害，外植体移接到培养基2～3 d后出现褐变死亡，最终全部死亡。说明杀菌剂和抗生素复合灭菌方法虽能杀死内生菌，同时也伤害植物组织。
2.5 不同灭菌方法对嫩叶外植体细胞活性的影响
由图2可知，三种灭菌方法对嫩叶外植体细胞活性存在明显差异，臭氧与升汞复合灭菌法影响最小，升汞灭菌法次之，次氯酸钠与升汞复合灭菌法影响最大；升汞单独灭菌前17 min，细胞活力下降不明显，细胞活力只下降8%，但灭菌20 min，活力下降29%，具显著差异；升汞和次氯酸钠联合灭菌14 min后对植物细胞活力即有显著差异，灭菌20 min后，其细胞活力下降60%；升汞与臭氧联合灭菌有提高细胞活力的作用，尽管随灭菌时间延长，活力出现下降趋势，但不同灭菌时间对植物细胞活力无明显差异。
3 讨论与结论
TTC法验证了不同灭菌方法对植物细胞活性的影响。升汞灭菌时间的延长使细胞活性逐渐降低，但17 min前无明显差异，20 min才达到明显差异，升汞使细胞活性下降的主要原因是使植物细胞蛋白质变性，但植物组织对升汞的渗透性差，阻碍其作用，因此需有相应作用时间才能使细胞活性出现明显下降。本试验结果显示，次氯酸钠溶液对植物外植体造成较严重的伤害，短时间作用（14 min）就可使细胞活力出现明显下降，造成愈伤组织诱导率低，效果最差。这可能与次氯酸钠强烈的氧化作用及较好的组织渗透性有关，另外次氯酸钠对植物材料特别是叶子有强的漂白作用。外植体经过臭氧灭菌后细胞活力反而高于空白对照，可能与臭氧的护色作用作用有关。本试验过程中发现，用次氯酸钠灭菌时，植物脱色很厉害，植物马上死亡，而臭氧处理的植物，颜色很鲜绿，活力高；其次TTC测定活力的原理是作为脱氢酶的受氢体被还原成为红色物质，因此植物细胞活性测定结果与其细胞内的脱氢酶活性密切相关。植物中残留的臭氧分子可能消耗脱氢酶产生的氢，从而使脱氢反应不断进行，对脱氢酶有激活作用，其具体原因有待进一步研究。
消毒是组织培养的基础，组织培养中外植体消毒好坏直接影响到后续的研究。本试验引入臭氧对热带植物外植体进行灭菌，臭氧具有杀菌迅速，可以弥散而均匀，杀菌无死角等特点。在75%酒精1 min，臭氧灭菌30 min，0.1% HgCl2溶液10 min时，可获得较低的污染率（5%）与较高的愈伤组织诱导率（95%），解决了野生海南粗榧外植体污染严重的问题。
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责任编辑：古小玲
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