新城疫病毒的分离与鉴定

材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1病料来源。2014年10月从扬州市几个活禽交易市场采取鸡的泄殖腔棉拭子40 份。

1.1.2试验动物。10 日龄SPF 鸡胚，购自北京梅里亚维通动物技术有限公司。

1.1.3标准阳性血清。

新城疫LaSota 株标准阳性血清， 由扬州大学兽医学院病理教研室自制， HI 为210； 禽流感（ H9 和H5） 单因子阳性血清，由扬州大学兽医学院病理研究室自制，HI均为211。

1.1.41%鸡红细胞。采集至少 3 只 SPF 公鸡或无禽流感或新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用pH7.2的0.01 mol/L PBS 液洗涤 3 次，每次均以 1 500 r/min 离心10 min，洗涤后用 PBS 配制成体积分数为 1% 红细胞悬液，4 ℃下保存备用。

1.2病毒的分离

1.2.1病料处理。

从扬州市几个活禽交易市场采集鸡泄殖腔棉拭子样品，共计 40 份。样品反复冻融3次，4 000 r/min 离心5 min，取上清液作为待检样品。

1.2.2鸡胚接种。

每个样品接 2 枚，每枚经尿囊腔途径接种 0.2 ml，置 37 ℃ 孵育 5 d，弃去 24 h 内死亡的胚，24 h 后死亡的鸡胚收取尿囊液，120 h未死亡的鸡胚，4 ℃下过夜，收取其尿囊液。

1.3血凝试验及血凝抑制试验将无菌收集的鸡胚尿囊液以 1.0% 鸡红细胞悬液采用 β 微量法进行 HA 试验，以 HA 价 ≥3 log2 为试验阳性。对有直接血凝性的样本进行 NDV 以及 H5 亚型 和 H9 亚型 AIV HI 试验。

1.4NDV F 基因部分片段序列测定与分析

1.4.1

提取RNA 。取尿囊液 350 μl，加入 700 μl 的 Trizol 液，混匀；室温放置 10 min，然后加入 200 μl 的氯仿异戊醇，盖紧漩涡振荡器摇荡 15 s左右，室温静置 10 min 后，在 4 ℃条件下12 000 r/min 转速离心 10 min；取上层水相于一新的 Ep 管，加入550 μl 等量异丙醇，室温放置 15 min，4 ℃条件下12 000 r/min 离心 10 min；弃去上清液加入 700 μl 的经 70% DEPC 处理的乙醇，轻轻颠倒数次混匀，4 ℃条件下12 000 r/min 离心 10 min；小心弃去上清液，室温干燥 5～10 min；加入 10.5 μl DEPC 处理的水中，放置 10 min 后用于 cDNA 的合成。

1.4.2cDNA 的合成。取 5 μl 含 RNA的DEPC 水于经过DEPC 处理的 200 μl Eppendorf 管中；加入反转录引物 1 μl、2.5 mmol dNTP 2 μl，70 ℃ 温浴 10 min，快速置冰上 5 min，稍微离心；快速加入 5×AMV buffers 5 μl、Rnasin 1 μl、RNA 反转录酶 （AMV）1 μl、DEPC 水 10 μl，瞬间离心；继续 42 ℃ 水浴 60 min，70 ℃ 15 min温浴终止反应。

1.4.3RTPCR。

PCR 体系（25 μl 体系）：模板（cDNA） 2 μl、上游引物 1 μl、下游引物 1 μl、mix Taq 预混酶 12.5 μl、ddH2O 8.5 μl。RTPCR反应条件：95 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s，54 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。取25 μl反应产物在1%琼脂糖电泳中进行检验。设置DL 20000 DNA Marker；调节电压为 80～100 V，电泳 40 min左右；小心取出凝胶，放入凝胶成像仪中，观察照相，保存图片。若有条带，切胶测序。

1.4.4NDV F基因序列分析。参照Liu等[4]的方法选取分离毒株F基因与GenBank中发表的NDV参考毒株相应片段进行分析。

2结果与分析

2.1病毒分离与鉴定

从 40 份病料中成功分离出4株新城疫病毒，分别简称为YZ14、YZ22、YZ29、YZ34，其 HA 效价分别为25、24、25和23；使用新城疫阳性血清、H9N2亚型禽流

感病毒阳性血清和H5亚型禽流感病毒阳性血清，对分离到

的

4株有血凝价的病毒进行HI效价检测发现，分离到的病毒与H9和H5亚型的阳性血清反应阴性，而与新城疫阳性血清的血凝效价很高，分别为29、28、210和29（表1）。

应用新城疫病毒的特异性引物对分离株的基因组 RNA 进行 RTPCR，反应产物经过1% 琼脂糖凝胶电泳观察，得到特异性扩增条带，YZ14、YZ22、YZ29、YZ34 NDV毒株与预期设计的F基因的扩增片段大小相符均约为1 100 bp。1%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。

2.2NDV F基因序列分析

2.2.1分离株与参考毒株的同源性比较。

将RTPCR产物送测序，与GenBank 中已发表的参考毒株F基因的核苷酸序列进行对比分析。从图2可以看出，此试验分离到的NDV毒株的F基因与Genbank已发表的NDV参考弱毒株的同源性介于73.2%～77.9%；然而，分离到的NDV之间具有较高的同源性，介于86.3%～93.9%。系统进化树分析表明，这几株分离毒株与LaSota株亲缘性较近，属于同一分支（图3）。

2.2.2分离株的裂解位点分析。分析F蛋白裂解位点附近的氨基酸序列发现，YZ14、YZ22、YZ29、YZ34 4株病毒F蛋白裂解位点序列为112ERQERL117，具有典型的NDV弱毒株特征。

3讨论

20世纪90年代以来，新城疫虽然没有形成世界性的大流行，但是我国鸡群新城疫发病逐年加重，新城疫感染的空间比例不断扩大。自1998年以来，世界范围以及我国出现机率最高的流行毒株的基因型为基因Ⅶ型，近年来新发生鹅源NDV分离株大部分也属于该型。NDV虽然只有1个血清型，但病毒的毒力可随病毒宿主和外界条件的变化而改变。 该试验对活禽市场的表征正常的 40 只鸡采集泄殖腔棉拭子，从 40 份病料中成功分离到4 株新城疫病毒，总阳性率为10%。

新城疫病毒的F基因裂解位点处氨基酸的组成与病毒毒力具有非常密切的关系。F蛋白是决定新城疫病毒毒力的主要因素。F0裂解位点氨基酸的组成与毒株的毒力有很大的关系。国内外研究表明，NDV强毒株F0蛋白裂解位点的氨基酸序列一般为112R/K-R-Q-K/R-R-F117，而弱毒株在该位点则以中性氨基酸代替碱性氨基酸，尤其是112位和115位，从而使相应序列成为112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117，这种F0蛋白不易裂解，以非活性的形式插入子代病毒子中，没有膜融合活性，感染性很低或无感染性。笔者通过对分离株的F基因氨基酸序列分析发现，分离株裂解位点附近的氨基酸残基组成均为112ERQERL117，符合弱毒株裂解序列特征。

大量研究表明，来自水禽的NDV能够在易感宿主鸡或火鸡体内逐渐演变为强毒力NDV[5-7]。于圣青[8]研究表明无毒性的鹅源NDV在易感宿主鸡的体内发生了毒力返强现象，随着在气囊传代次数的增加，病毒毒力也随之增强，并逐渐变成了泛嗜性病毒；F蛋白裂解位点的序列也由开始时的112ERQERL117变为112ERQGRL117 （气囊传代8次），再变为112ERQKRL117 （气囊传代9次），最终变成112ERQKRF117（气囊传代9次+脑内传代1次）。虽然，对活禽市场随机采集的家禽泄殖腔棉拭子分离到的4株NDV的裂解位点氨基酸分析发现，这4株NDV分离株均为弱毒株，但是依然存在一定的潜在威胁，如小型活禽市场一般都没有将不同种家禽分离开来。相关研究表明，从发病鹅群分离的NDV对鸡具有高度的致病性，直接感染或间接接触感染都可导致鸡100%的发病率和死亡率[9]。同时，从分离株与参考株的 F 基因核苷酸序列同源性比较中看出分离到的NDV之间具有较高的同源性，介于86.3%～93.9%，且这些分离株与疫苗株LaSota的 F 基因属于同一分支，这也很大程度上说明可能是由于我国多年来一直采用以疫苗接种为主、隔离消毒为辅的控制ND流行措施的副作用。

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