摘要 [目的]对抗浪鱼MC4R基因进行PCR扩增。[方法]采用PCR方法，依据鲫鱼的黑素促黑素受体4（MC4R）基因保守区的核苷酸序列，采用引物设计软件，对抗浪鱼的MC4R基因设计出一对引物进行PCR扩增和纯化测序，并利用phylip软件对抗浪鱼和其他已知MC4R基因序列的鱼类构建基因进化树。[结果]抗浪鱼MC4R基因的扩增长度为1 001 bp。9种鱼类的MC4R核苷酸序列聚为2大类。其中，比目鱼单独聚为一类；斑剑尾鱼、舌齿鲈、白斑角鲨、斑马鱼、抗浪鱼、黑青斑河豚、中华多纪豚和红旗东方豚聚为一类。[结论]抗浪鱼与斑马鱼的亲缘关系最近，与比目鱼的亲缘关系最远。
关键词 抗浪鱼；MC4R基因；多聚酶链反应；进化树
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）17-05385-02
Abstract [Objective] MC4R gene from Schizothorax taliensis was amplified by PCR method. [Method] The primers were designed by the conservative MC4R of Crucian carp gene sequence. After the purification and sequencing， polygenetic tree for MC4R gene of Schizothorax taliensis and other fish species was constructed using phylip software. [Result] The MC4R gene of Schizothorax taliensis is 1 001 bp in length. MC4R nucleotide sequences of 9 fish species were clustered into 2 categories. Paralichthys olivaceus clustered into a separate category， Poeciliidae， Dicentrarchus labrax， Squalus acanthias， zebra fish， Schizothorax taliensis， black spot puffer， black spot puffer and red fugu belonged to another category. [Conclusion] The closest relative is zebra fish and the relationship of the farthest grouper is Paralichthys olivaceus.
Key words Schizothorax taliensis； MC4R gene； PCR； Polygenetic tree
抗浪鱼，原名鱇鱼浪白鱼（Anabrilius grahami），属鲤形目（Cypriniformes）鲤科（Cyprinidae）鮊亚科（Cultrinae）白鱼属（Anabarilius），是云南特有的4大土著名鱼之一。抗浪鱼仅分布于我国的抚仙湖，历史上产量曾占抚仙湖总渔产量的70%～80%，足见其在渔业中的重要地位，是产地重点保护和发展的主要对象[1]。
黑素促黑素受体-4（MC4R）属于黑素促黑素家族的一员。MC4R具有介导瘦素（leptin）蛋白的功能，是一个调节能量平衡与能量动态平衡的重要信号分子[2]，具有控制动物食欲、体重和能量代谢等作用[3]。1997年，Huszar等对敲除MC4R基因的小鼠进行了研究[4]，发现敲除MC4R基因的小鼠出现遗传性肥胖，表现出多食、胰岛素分泌过多以及肥胖等症状。MC4R可与脑部分泌的天然内原配体α促黑激素（alpha melanocyte stimulating hormone ，αMSH）结合，抑制摄食，导致血糖降低、低胰岛素和瘦素水平，从而减少体脂，降低体重，是一个调节动态平衡的重要信号分子[5-6]。近年来，MC4R基因在介导肥胖症中发挥的作用越来越受到人们的关注。Ringholm A[7]等研究指出，金鱼MC4R基因（gMC4R）在摄食上发挥作用，根据同源性比对，金鱼MC4R基因与人MC4R基因有68%相同，并且保存了重要功能领域。金鱼MC4R基因还参与体色的控制。其他鱼类如河豚鱼、斑马鱼、翻车鱼、鲤鱼中也有MC4R基因序列。将MC4R基因作为一个候选基因用于筛选与动物生长性状相关联的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）位点已经得到了广泛的应用。刘福平[8]等在对罗非鱼MC4R基因克隆及与其生长相关的SNPs位点的分析中，对罗非鱼MC4R基因启动子和外显子区域进行了SNPs位点的检测和分型，结果共检测到5个SNPs位点。
生物基因进化树是生物学家根据生物进化序列制成的树状结构，微观分子水平上的进化树（基因树）是20世纪50年代分子生物学问世之后形成的，可使人们直观、简明地认识地球上生物之间的亲缘和进化关系。如能找到影响抗浪鱼体重增长的基因无疑会带来巨大的经济价值和研究价值。试验根据鲫鱼的MC4R基因保守区的核苷酸序列设计1对引物，对抗浪鱼的MC4R基因进行提取、PCR扩增、测序，并与其他鱼类进行同源性分析，构建基因进化树，以期为进一步了解抗浪鱼MC4R基因的功能提供基础，并为抗浪鱼MC4R基因的SNPs检测和分型以及对抗浪鱼的分子标记辅助育种提供理论基础，为抗浪鱼的种群恢复提供帮助。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物。抗浪鱼，为云南澄江抚仙湖中的野生个体。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取。采用常规苯酚法抽提抗浪鱼基因组DNA。
1.2.2 MC4R基因PCR扩增。用于MC4R基因多态检测的引物序列参照文献进行合成。引物由上海生工公司合成。其序列为：上引：5’TCATACCGAAATCACAGC3’，下引：5’TCAACATCTATCTCCCAAAC3’。PCR反应体系为：水38.5 μl，10×Buffer 6 μl，dNTP 2 μl，上引物0.6 μl，下引物0.6 μl，DNA模板2 μl，Taq酶0.4 μl。
1.2.3 反应条件。92 ℃预变性8 min，92 ℃变性50 s，53 ℃退火50 s，72 ℃延伸65 s，共35循环；之后72 ℃后延伸8 min。PCR产物送由金瑞斯生物科技有限公司测序检测。
2 结果与分析
2.1 基因组DNA的检测
2.1.1 检测结果。取溶解的抗浪鱼的基因组DNA在含EB的1%的琼脂糖凝胶电泳检测。电泳条件问130 V，35 min。在凝胶成像仪上观察结果并扫描，结果见图1。
3 结论与讨论
研究表明，MC4R基因在动物体内下丘脑、胰腺、胃均有表达[9]，具有控制食欲、调节能量平衡的作用[10]。试验获得了完整的编码区序列，测序结果显示，抗浪鱼MC4R基因的扩增长度为1 001 bp，外显子996 bp。
试验利用phylip软件对抗浪鱼和其他已知MC4R基因序列的鱼类构建了基因进化树并进行分析。根据图谱显示，M9和M8分别为红旗东方豚和中华多纪豚，属于同一物种，与M7黑青斑河豚是一个属，从而证明试验所采用的phylip软件分析方法是正确的。也就是说，此进化树图谱具有一定科学性，可信度高。
经过分析发现抗浪鱼与比目鱼的亲缘关系最远，与斑马鱼的亲缘关系最近。首先，抗浪鱼与斑马鱼的亲缘关系近，2种鱼类的生活习性可能类似，那么抗浪鱼是否可以向斑马鱼一样生活在暖海域的沿岸，具有夜行性，特别是利用其嗅觉寻觅食物的特性，这是一个值得研究的课题；同时，可以尝试将斑马鱼引进放入抚仙湖中的环境下养殖。这种思路对其他鱼类也有借鉴意义。其次，抗浪鱼价格昂贵，生长缓慢，资源缺乏，有义务对其进行保护。然而在试验和开发的同时，避免不了捕捉抗浪鱼。根据抗浪鱼与其他鱼类的亲缘关系，如果努力找到亲缘关系近，数量多，易成活，繁殖率高的鱼类来代替抗浪鱼做相关的研究。这对抗浪鱼的保护具有重要的意义。
由此类推，抚仙湖鱼类资源丰富，若对抚仙湖中的鱼类进行基因分析和构建基因进化树找到鱼类之间的亲缘关系，可以找到物种间的进化关系，可以找到抚仙湖鱼类的起源，断定鱼类是否属于该地土著鱼种还是引进鱼种，同时还可以进行鱼类生活与抚仙湖水质环境的关系研究。抗浪鱼的这一研究对此都有重大的指导意义和应用意义。
试验根据鲫鱼的MC4R基因保守区的核苷酸序列，采用引物设计软件，对抗浪鱼的MC4R基因设计出一对引物进行PCR扩增，然后纯化测序，
测序结果显示，抗浪鱼MC4R基因的扩增长度为1 001 bp。同时利用phylip软件对抗浪鱼和其他已知MC4R基因序列的鱼类构建了基因进化树并进行分析。结果发现，抗浪鱼与比目鱼的亲缘关系最远，与斑马鱼的亲缘关系最近，从而为进一步了解抗浪鱼MC4R基因的功能提供基础，便于研究抗浪鱼与其它鱼类的亲缘与进化关系，为抗浪鱼MC4R基因的SNPs检测和分型以及对抗浪鱼的分子标记辅助育种提供前提理论基础，为抗浪鱼的种群恢复提供一定的帮助。
参考文献
[1] 蔡滨峰.抗浪鱼[J].河北渔业，2006（2）：62.
[2] ANDERSSON L.Melanocortin receptor variants with phenotypic effects in horse，pig and chicken [J].Ann N Y Acad Sci，2003，994 （6）：313-318.
[3] HOGGARD N，HUNTER L，DUNCAN J S，et al.Regulation of adipose tissue leptin secretion by alpha-melanocyte-stimulating hormone and agouti-related protein：Further evidence of an interaction between leptin and the melanocortin signalling system [J].J Mol Endocrinol，2004，32（1）：145-153.
[4] HUSZAR D，LYNCH C A，FAIRCHILD HUNTRESS V，et al.Targeted disruption of the melanocortin-4 receptor results in obesity in mice [J].Cell，1997，88（1）：131-141.
[5] ABDEL MALKEK Z A.Melanocortin receptors：their functions and regulation by physiological agonists and antagonists [J].Cellular and Molecular Life Sciences，2001，58（3）：434-441.
[6] BUROS C，CARRODEGUAS J A，MORENO C，et al.Allelic incidence in severasl pig breeds of a missense variant of pig melanocortin-4 receptor （MC4R） gene associated with carcass and productive traits [J].Meat Science，2006，73：144-150.
[7] RINGHOLM A，SCHITH H B，RAUDSEP T，et al.Remarkable synteny conservation of melanocortin receptors in chicken，human，and other vertebrates [J].Genomics，2003，81（5）：504-509.
[8] 刘福平，白俊杰，叶星，等.罗非鱼MC4R基因克隆及与其生长相关的SNPS位点 [J].中国水产科学，2009，16（6）：816-823.
[9] YEO G S H，FAROOQI I S，CHALLIS B G，et al.The role of melanocortin signalling in the control of body weight：evidence from human and murine genetic models [J].Q J Med，2000，93（1）：7-14.
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