材料与方法
1.1试验材料
猪小肠上皮细胞（IPEC-J2），购自广州吉尼欧生物有限公司;焦碳酸二乙酯（DEPC）、2×Easy Taq PCR Super Mix，购自北京百泰克生物有限公司;Lipofectamine 3000转染试剂，购自Lifetechnologies公司;胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶溶液[025% 胰酶-乙二胺四乙酸（EDTA）]，购自Gibico公司;DMEM高糖培养基，购自Hyclone公司。本试验于云南农业大学动物医学院动物病理实验室完成。
1.2试验方法
1.2.1猪小肠上皮细胞的培养于37 ℃水浴，使IPEC-J2尽量在1 min内完全融化，于4 000 r/min离心5 min，加入 1 mL DMEM培養液将底部细胞吹打均匀后，注入含有6 mL DMEM培养液和10%胎牛血清的细胞培养瓶内，轻缓摇晃使细胞均匀分布，然后置于37 ℃、5% CO2的温箱内培养。
1.2.2shRNA质粒的设计及构建根据美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站中的猪泛素基因的核苷酸序列，设计针对猪泛素基因保守区的shRNA序列UBC-sus-263（5′-GAGAACGTCAAGGCGAAGATC-3′），并设计阴性对照 UBC-shNC（5′-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3′），质粒载体为U6/GFP/Neo，带绿色荧光标记，由上海吉玛制药公司合成。将质粒DNA溶液于-20 ℃保存，对应的甘油菌液于 -80 ℃ 保存。
1.2.3泛素基因沉默在六孔板中培养IPEC-J2细胞，当汇合度达到80%左右时将培养液换为2 mL无血清、无抗生素的DMEM培养基，开始转染。转染分为空白细胞对照组、shRNA质粒转染组和空白质粒转染组，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，分别在培养6、12、24、48 h时收集细胞及其上清。
1.2.4引物设计本试验选用β-actin作为内参基因，在NCBI网站中查找公开发表的β-actin、TLR4、NF-κB、MyD88和IκB-α基因序列，遵循实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）的引物设计原则，利用Primer 6.0软件设计引物，并由深圳华大基因股份有限公司合成，引物序列如表1所示。
1.2.5Real-Time PCR提取细胞总RNA，然后按照反转录说明书于冰上配制反应液，反转录结束后按下列组分配制荧光定量PCR反应液：12.5 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RnaseH Plus）（2×），各0.7 μL PCR上下游引物（10 μmol/L），2.0 μL模板，9.1 μL dH2O，将上述反应液加入0.2 mL八联排管中混匀，离心，在Bio-Rad Real-Time PCR仪上进行反应，反应程序设置如下：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，Tm 20 s，72 ℃ 30 s，40个循环;溶解曲线55 ℃ 30 s，81个循环。结束后保存数据，并计算各指标的mRNA相对表达量。
1.2.6酶联免疫吸附试验（ELISA）检测采集不同时期各处理组的细胞培养上清液，用ELISA试剂盒检测IκB-α、NF-κB 及炎性因子 IL-1、TNF-α的含量。
1.2.7数据处理本试验中的所有数据均用SPSS 16.0进行统计分析，试验结果以平均值±标准差（x[TX-*5]±s）表示，用单因素方差分析比较各组均值的差异显著性。
2结果与分析
2.1转染shRNA质粒后IPEC-J2细胞中泛素基因的表达情况
根据24、48 h的反应循环数（CT值），计算shRNA质粒转染IPEC-J2细胞后Ub基因的mRNA相对表达量。如图1所示，UBC-sus-263的shRNA质粒对泛素基因的沉默效果较好，在2个时间点中，其表达量均仅为空白细胞组的2%，表现出极显著差异（P<0.01）。
2.2IPEC-J2细胞中TLR4、NF-κB、IκB-α 及MyD88的mRNA表达量
由图2-A可以看出，shRNA质粒转染IPEC-J2后，细胞内的TLR4表达量明显降低，相较于对照组显示出极显著差异，在24 h时降至最低值。而空白质粒组转染后细胞内的TLR4表达量较空白细胞组略微升高，6 h时差异极显著，24 h时差异显著，其他时间点差异不明显。由图2-B可以看出，shRNA质粒表达载体转染IPEC-J2后，细胞内的 NF-κB 表达量明显降低，相较于对照组表现出极显著差异，在12 h时降至最低值。而空白质粒组转染后细胞内的NF-κB表達量较空白细胞组升高，在6 h时与对照组相比差异显著，12、48 h与空白对照组相比表现出极显著差异。由图2-C可以看出，shRNA质粒转染IPEC-J2后，细胞内的IκB-α表达量明显降低，相较于对照组表现出极显著差异，在24 h时降至最低值。而空白质粒组转染后细胞内的IκB-α表达量较空白细胞组呈上升趋势，12、24 h时与空白对照组差异显著，48 h 时差异极显著。由图2-D可以看出，shRNA质粒转染IPEC-J2后，细胞内的MyD88表达量明显降低，相较于对照组显示出极显著差异，在48 h时降至最低值。而空白质粒组在6、48 h时细胞内的MyD88表达量较空白细胞组略微升高，而12、24 h时的表达量略微降低，与空白对照组间差异不显著。
2.3IPEC-J2细胞中细胞因子的ELISA检测结果
由图3-A可以看出，在各时间点，shRNA质粒转染组细胞中的NF-κB含量明显低于空白细胞组、空白质粒转染组，6 h时与空白组间差异极显著，其余时间均显示出显著差异。由图3-B可以看出，在转染12～48 h，shRNA质粒转染组细胞中的IκB-α含量明显低于空白细胞组、空白质粒转染组，并在12、48 h时与空白对照间显示出显著差异，24 h时差异极显著。由图3-C可以看出，在各时间点，shRNA质粒转染组细胞中的TNF-α含量明显低于空白细胞组、空白质粒转染组，并在6、24、48 h时与空白对照组间显示出极显著差异，12 h时差异显著。由图3-D可以看出，在各时间点，shRNA质粒转染组细胞中的IL-1含量明显低于空白细胞组、空白质粒转染组，并在24、48 h时与对照组显示出极显著差异，在6、12 h时与空白对照组间差异显著。
3讨论
在TLR4/NF-κB信号通路中，泛素扮演着重要的角色，研究认为，很多泛素化抑制因子可以作为治疗许多疾病的新靶点[11-14]。Marfella等的研究表明，通过免疫组织化学方法和酶联免疫分析的方法，应用罗格列酮抑制泛素-蛋白酶体途径，可以通过减少IκB（转录核因子κB抑制子）的降解，从而抑制与NF-κB相关的炎症过程[15]。目前，针对泛素蛋白酶体系统的生物学靶点已经在蛋白酶体抑制剂与E1（泛素活化酶）、E2（泛素结合酶）、E3（泛素连接酶）方面得到扩展。在大多数肿瘤细胞中，泛素分子都呈高表达状态[16]。Choongseob等通过降低泛素UBB基因的表达量而成功抑制了体内、外肿瘤细胞的生长，其机制是通过促进细胞凋亡及调节NF-κB分子通路实现的[17-18]。因此可见，泛素化是调节NF-κB活化的一种重要机制。
在本试验中，通过构建shRNA质粒对泛素基因进行沉默，下调或终止其表达，可以达到抑制泛素蛋白合成的目的，研究转染该质粒后对猪小肠上皮细胞中TLR4/NF-κB信号通路的作用。结果显示，细胞内TLR4的mRNA表达量比空白对照组和空白质粒转染组低，随着转染时间增加，表达量逐渐降低，并在24 h时降至最低值;NF-κB的mRNA表达量也明显低于空白细胞组和空白质粒转染组，在12 h时降至最低值后逐渐升高，但仍低于空白细胞组中的NF-κB含量;IκB-α、MyD88的mRNA表达量也都低于同组的空白细胞组和空白质粒转染组，并且随着转染时间的增加，mRNA的表达量逐渐降低，均在24 h时出现最小值。试验结果表明，泛素基因沉默以及泛素的表达量下调，对TLR4/NF-κB信号通路起到了抑制作用，各下游分子的表达量均出现降低，其抑制作用很可能是通过抑制泛素化降解IκB而实现的。
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