不同提取方法提取辣椒及其制品中DNA效果研究

材料与方法

1.1    试验材料

试验材料有鲜辣椒、干辣椒、油辣椒和辣椒酱，均购自市场。

试剂有Premix Ex Taq（Probe qPCR）（荧光PCR反应液）、DL2000 DNA Marker 、MiniBEST Universal Genomic DNA Ext-raction Kit（DNA提取试剂）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）、蛋白酶K、氯仿/异戊醇（24∶1）、75%乙醇、GoldView核酸染料，均购买于宝日医生物技术有限公司。

仪器有实时荧光PCR仪（7500 Fast，美国Applied Bios-ystems）、化学发光凝胶成像系统（DOC XRS，美国Bio-rad）、凝胶电泳仪（PowerPac 3000，美国Bio-rad ）、高速冷冻离心机（Microfuge 22R Centrifuge，美国Beckman Coulter）、超纯水仪（Milli-Q，美国Milli-pore）、核酸蛋白测定仪（NanoDrop 2000，美国Thermo Scientific）、冷冻混合球磨仪（MM400，德国Retsch）、移液器、涡旋振荡器、恒温金属浴锅、生物安全柜等。

1.2    DNA提取方法

针对辣椒制品需做样品前处理，采用洗涤方式，尽量去除样品中的其他物质（如盐、糖、添加剂及其发酵产物等）。取适量样品与2倍体积的超纯水至50 mL离心管中，充分混匀，于离心机离心5 min（12 000 r/min），弃上清，重复洗涤3～5次。对于辣椒酱、油辣椒等液体样品，可使用均质器破坏样品的稳定性并加以分离、浓缩，取适量样品与2倍体积的超纯水至2 mL离心管中，充分混匀，于离心机离心5 min（12 000 r/min）弃上清，重复洗涤3～5次。

1.2.1    CTAB法。取2% CTAB抽提缓冲液于65 ℃金属浴中预热，取样品约0.3 g置于球磨仪（液氮处理）研磨，加入700 μL 2% CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动，将磨碎液分倒入1.5 μL灭菌离心管中，于 65 ℃金属浴加热振荡10 min，加入5 μL 5 mol/L醋酸钾溶液，混匀，再金属浴20 min;取出离心管后置于冰上，加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），轻轻来回颠倒，充分混匀;放入4 ℃高速冷冻离心机中（12 000 r/min）离心15 min，吸取上清液500 μL放入另一离心管中，加入等体积异戊醇，颠倒混匀;12 000 r/min离心10 min后，弃上清，加入500 μL 75%乙醇，轻弹离心管，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中，放置30 min，使DNA块状物上的不纯物溶解;在12 000 r/min条件下离心5 min后弃上清，加入等量75%乙醇再洗30 min，然后再12 000 r/min离心5 min，弃上清液，并将离心管倒立于滤纸之上，自然风干，加入50 μL TE溶液，使DNA溶解，置于-20 ℃冰箱冷冻保存、待用。

1.2.2    SDS法。称取0.3 g样品放入球磨仪（液氮处理）中研碎，迅速放入1.5 mL离心管中，加700 μL SDS提取液，充分混匀，于65 ℃金属浴加热振荡30 min;取出离心管，加入5 μL 5 mol/L醋酸钾溶液，混匀，再金属浴20 min;取出离心管后放置在冰上，加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），轻轻地来回颠倒，使管液充分混匀;放入4 ℃高速冷冻离心机中（12 000 r/min）离心15 min，吸取上清液500 μL放入另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），颠倒混匀，然后12 000 r/min离心10 min，再吸取上清液500 μL于另一离心管中，重复上一步骤;吸取上清液于另一干净的离心管中，加入0.6～1.0倍体积的异丙醇，轻轻地来回颠倒，出现絮状DNA沉淀，再放入-20 ℃冰箱冷冻室30 min沉淀核酸;然后在12 000 r/min条件下离心5 min后，倒掉液体，加入500 μL 75%乙醇再洗涤30 min;在12 000 r/min条件下离心5 min之后，倒掉液体，并将离心管倒立于滤纸之上，自然風干，加入50 μL TE溶液溶解DNA，放置于-20 ℃冰箱冷冻保存、待用。

1.2.3    吸附柱法（试剂盒）。取0.3 g样品加入1.5 mL离心管，再加入180 μL Buffer GL、20 μL  Proteinase K和10 μL RNase A（10 mg/mL），于56 ℃水浴（或用加热振荡器）至组织完全裂解（30 min）;在12 000 r/min条件下离心5 min，取上清至另一离心管中，并加入200 μL Buffer GB和200 μL 100%乙醇，充分混匀;将溶液移至Spin Column中，在12 000 r/min条件下离心2 min，弃滤液，将500 μL Buffer WA加入至Spin Column中，在12 000 r/min条件下离心1 min，弃滤液;将500 μL 75%乙醇加入至Spin Column中，在12 000 r/min条件下离心1 min，弃滤液。重复该步骤1次，弃滤液后再离心2 min;将Spin Column安置于新的1.5 mL离心管上，在Spin Column膜中央处加入50 μL TE溶液，室温静置5 min;在12 000 r/min条件下离心5 min洗脱DNA，置于-20 ℃冰箱冷冻保存、待用。

1.3    DNA浓度及纯度检测

1.3.1    核酸蛋白测定仪检测。利用核酸蛋白测定仪检测SDS法、CTAB法、吸附柱法提取鲜辣椒、干辣椒、油辣椒、辣椒酱中的DNA，测260 nm和280 nm处的吸光值，并记录，通过OD260/OD280值判断提取DNA的纯度。

1.3.2    琼脂糖凝胶电泳检测。吸取3 ？滋L DNA在1%琼脂糖凝胶电泳上进行电泳，GoldView染色、蒸馏水冲洗后，放入化学发光凝胶成像系统观察、拍照。以电泳图来确定提取的DNA完整度及RNA是否去除。

1.3.3    实时荧光PCR扩增检测。为进一步检测SDS法、CTAB法、吸附柱法提取不同样品的基因组DNA中是否存在PCR扩增抑制。以提取得到的DNA为模板，以辣椒内源基因CaATL1为参考基因，其具有保守、拷贝数稳定等特征。所使用反应体系见表1，扩增程序见表2。

2    结果与分析

2.1    核酸蛋白测定仪检测结果

经核酸蛋白分析仪测定表明，用CTAB法、SDS法、吸附柱法对鲜辣椒、干辣椒、油辣椒、辣椒酱提取，均能抽提得到DNA。从样品的抽提物纯度OD260/OD280比值（表3）来看，CTAB法提取物纯度较低，其次是SDS法，而吸附柱法的提取物纯度较高。

2.2    琼脂糖凝胶电泳检测结果

如图1所示，CTAB法、SDS法、吸附柱法均能从指定样品中提取出DNA，均无大范围明显拖尾，说明DNA完整性较好。从泳道中可看出，吸附柱法提取的目标条带较亮，这与吸附柱的过滤吸附功能有关，对DNA基因组及其片段有较强的吸附获取作用，在3种方法中以吸附柱法提取的DNA效率最高。而SDS法和CTAB法条带较吸附柱法暗，提取到的DNA量相对较少，其中CTAB法对油辣椒和辣椒酱的DNA提取量最少，说明其针对深加工辣椒制品的DNA提取效率较低。

2.3    实时荧光PCR扩增检测结果

3种提取方法的鲜辣椒、干辣椒、油辣椒、辣椒酱基因组DNA均出现了PCR扩增曲线。对比同个样品，从实时荧光PCR扩增曲线的Ct值大小比较可得出，吸附柱法  <SDS法<CTAB法（表4），即提取方法效率越高，获得DNA浓度越高，实时荧光PCR扩增Ct值越小。

3    结论与讨论

从深加工的辣椒制品中提取DNA比从辣椒原料中提取相对困难，因为辣椒制品中富含多种食品添加剂且加工过程复杂，影响DNA提取的质量和完整度。经过试验比较，确定提取方法的效率由高到低依次为吸附柱法>SDS法 >CTAB法。

在分子生物学标准上，OD260/OD280值是判断DNA纯度的依据。符合要求、纯度高的纯化DNA，其OD260/OD280值在1.7～1.9之间，低于此范围表示所提取样品的DNA中含有蛋白质污染，高于此范围表明样品中有RNA污染。提取的样品中存在着较多的多酚、多糖，也是导致OD260/OD280值偏低的原因之一。因此，在操作過程中需要注意多糖、多酚等杂质的去除。

通过核酸蛋白测定仪、琼脂糖凝胶电泳分析及实时荧光定量PCR检测进行比较，确定采用吸附柱法提取核酸的效率较高。根据核酸提取的原理可以看出，使用过滤膜吸附的过程中，含有基因组的混合液与之进行结合，在较短时间内仍然可以获得纯度及浓度较高的DNA;而CTAB法、SDS法操作时间较长且通过异戊醇、异丙醇沉淀DNA，效率较低。并且在针对辣椒制品进行提取时，更容易受到盐类、蛋白质、多糖的影响，故其所提取的DNA纯度较低。本次研究针对辣椒及其制品的成分特点，确定吸附柱法为最适宜辣椒及其制品核酸提取的方法。该提取方法具有用时少、效率高、提取核酸质量纯且稳定等优点。

4    参考文献

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