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1.1 试验材料
1.1.1 供试仪器。电子天平（型号为FA2204N），购自瑞安市安特称重设备有限公司;高速离心机（型号为TDL-60B），购自上海安亭科学仪器厂;梯度基因扩增仪，购自德国Eppe-ndorf公司;水平电泳仪（型号为DYY-6C），购自北京市六一仪器厂;BIO-RAD Gel Doc XR+凝胶成像分析系统（型号为1708195），购自美国伯乐公司。
1.1.2 供试试剂。蛋白酶K购自Merck公司，2×Taq PCR Master Mix、DL2000 DNA Marker、GreenView核酸染料、柱式DNA胶回收试剂盒等均购自天根生化科技（北京）有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 虫体的采集及保存。从四川省凉山彝族自治州自然感染的5只山羊胰管内采集枝睾阔盘吸虫样品，用灭菌生理盐水清洗干净，进行形态学鉴定后，分别编号为LS01～LS05，于-20 ℃条件下保存备用。同一只山羊分离出的枝睾阔盘吸虫为1个分离株。
1.2.2 枝睾阔盘吸虫虫体总DNA提取。从冷冻保存的5个山羊枝睾阔盘吸虫样品中分别随机取出1条，用剪刀剪碎并研磨，加入1 μg/μL SDS裂解液和10 μg/μL蛋白酶K，放入56 ℃水浴锅中消化过夜，然后将消化好的虫体悬液用酚/氯仿法[8]提取虫体总DNA，保存于-20 ℃条件下备用。
1.2.3 枝睾阔盘吸虫nad4基因扩增及序列测定。用Chang等[9]报道的引物进行枝睾阔盘吸虫nad4基因部分序列的扩增。由上海杰李生物技术有限公司合成引物序列，引物序列如下：nad4P1为5′-GTT TTG ATG TTT TTA TGA GT-3′;nad4P2为5′-CTA ATA TGA CGA ACC AGG AA-3′。PCR扩增体系为50 μL：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，引物nad4P1、nad4P2（10 pmol/μL）各2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。同时，以ddH2O作空白对照。扩增条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性40 s，45 ℃复性40 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环;最后72 ℃延伸6 min。反应结束后分别取5 μL PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统检测目的条带的大小。各PCR扩增产物经柱式DNA胶回收试剂盒进行回收纯化后送上海杰李生物技术有限公司测序。
1.2.4 序列分析及系统进化分析。检索GenBank收录的部分吸虫的nad4基因序列并下载（表1），然后用Clustal X 1.81软件进行序列比对，MEGA 5.0软件分析碱基组成，基于p-distance模型计算遗传距离;用DNAstar 中的MegAlign程序进行序列同源性分析;用DnaSP 4.0软件计算单倍型数（ha-plotypes，H）、核苷酸多样性（Nucleotide diversity，Pi）、单倍型多样性（Haplotypes diversity，Hd）和平均核苷酸差异（average number of nucleotide differences，K）。以猪带绦虫（Taenia soli-um，AB086256）作为系统发育分析的外群，采用p-distance模型，用MEGA 5.0软件构建NJ树，并进行重复1 000次的自举检验（bootstrap test）。
2 结果与分析
2.1 枝睾阔盘吸虫nad4基因部分序列的特征和同源性比较
比对校正剔除多余序列后，本研究测得的5个枝睾阔盘吸虫凉山州分离株的nad4基因部分序列长度均为789 bp（占全长的61.7%），A+T碱基的平均含量为61.4%。5个测序序列均不存在碱基插入/缺失，其中保守位点785个，变异位点4个（简约信息位点、单变异位点各2个）。核苷酸变异位点主要发生在密码子第1位（占50%），第2位和第3位各占25%，且全为转换（3个A-G、1个C-T），无颠换。
5个枝睾阔盘吸虫凉山州分离株测序序列的同源性为99.5%～100.0%，碱基变异率为0～0.5%。5个测序序列与胰阔盘吸虫的同源性为85.8%～85.9%，与矛形双腔吸虫、中华双腔吸虫、華支睾吸虫、大片吸虫、鹿前后盘吸虫的同源性均低于70%。
2.2 遗传多样性分析
5个山羊源枝睾阔盘吸虫的nad4基因部分序列共检测到4个单倍型，遗传距离为0～0.005（平均遗传距离为0.003），与胰阔盘吸虫的遗传距离为0.402～0.406，与矛形双腔吸虫、中华双腔吸虫、华支睾吸虫、大片吸虫、鹿前后盘吸虫的遗传距离均≥0.493。5个测序序列总的单倍型多样性（Hd）和核苷酸多样性（Pi）分别为0.900和0.002 53，平均核苷酸差异（K）为2.000。
2.3 系统发育分析
基于nad4基因部分序列构建的NJ树（图1）显示，5个山羊源枝睾阔盘吸虫凉山州分离株单独聚为一支，未与胰阔盘吸虫聚在一支上，而胰阔盘吸虫与中华双腔吸虫和矛形双腔吸虫聚类在同一小支上，与形态学分类的结果不一致。
3 结论与讨论
目前，对胰阔盘吸虫和腔阔盘吸虫的研究主要集中在虫体形态结构、发育过程及阔盘吸虫病的感染情况调查、诊断和综合防治等传统寄生虫学方面，分子水平的研究较少。
用于胰阔盘吸虫和腔阔盘吸虫分子分类的靶分子主要有18S rRNA[13-15]、ITS-2[15]，虽然已有胰阔盘吸虫线粒体基因组全序列的报道[9]，但并未见基于线粒体基因对胰阔盘吸虫、腔阔盘吸虫、枝睾阔盘吸虫等进行分析的报道。
本研究对测序获得的5个山羊源枝睾阔盘吸虫凉山州分离株的nad4基因部分序列进行分析，发现其核苷酸同源性为99.5%～100.0%，平均遗传距离为0.003，构建的进化树显示枝睾阔盘吸虫凉山州样品位于同一分支，与其他吸虫得到了很好地鉴别。
本研究对采集自凉山州山羊源的枝睾阔盘吸虫nad4基因的部分序列进行扩增和序列分析，结果表明，枝睾阔盘吸虫的nad4基因部分序列种内相对保守，种间差异加大，说明nad4序列片段可作为枝睾阔盘吸虫种间鉴定及种内遗传变异研究的标记。研究结果为进一步研究枝睾阔盘吸虫的分子分类、遗传变异奠定了基础。
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