对照组（n=10）和实验组（n=10），适应性饲养两周后，采用改良的单一连续应激方法（SPS&S）制备PTSD大鼠模型，TUNEL方法检测海马神经元凋亡变化。结果：PTSD大鼠海马神经元的凋亡率高于对照组。结论：海马区神经元的凋亡与PTSD的发病有关。
关键词：PTSD大鼠模型；海马神经元；神经元凋亡；TUNEL；病理改变 文献标识码：A
中图分类号：R749 文章编号：1009-2374（2017）06-0083-02 DOI：10.13535/j.cnki.11-4406/n.2017.06.042
创伤后应激障碍（Posttraumatic Stress Disorder，PTSD）是由异常心理创伤导致的延迟出现的持续性精神障碍，是一种对创伤因素的异常精神反应，近年来其病率越来越高，给社会带来了严重的经济负担。研究表明，PTSD患者出現海马萎缩、体积缩小现象，其机制尚未阐明。我们推测海马神经细胞凋亡可能是导致这种现象的原因之一，本研究给予大鼠SPS&S应激建立PTSD模型，利用TUNEL方法检测PTSD发病中海马神经元的凋亡情况，从而揭示创伤后应激障碍发病时海马区结构及功能发生异常的原因，为研究创伤后应激障碍的发病机制提供有效的实验依据。
1 动物
体重为23±20g的健康雄性Wistar大鼠20只，购于华北理工大学实验动物中心，实验动物合格证号：SCXK 京2009-0004。
2 主要试剂及仪器
TUNEL-POD细胞凋亡检测试剂盒购于上海七海复泰生物科技有限公司，-20℃保存。DAB显色液购于中杉金桥生物技术有限公司，4℃保存。组织包埋机、石蜡切片机、光学显微镜、防脱拨片、PBS缓冲液。
3 实验方法
3.1 动物分组及模型建立
动物喂养于华北理工大学实验动物中心，适应性饲养两周后（温度22℃～25℃、噪声≤60dB、自由饮水摄食，12h白昼12h黑夜自然光照条件），20只Wistar大鼠随机分为四组，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组，每组5只，其中Ⅰ、Ⅱ组为对照组，Ⅲ、Ⅳ组为实验组。实验组采用改良的单一连续应激方法建立PTSD大鼠模型（禁锢2h，强迫游泳15min，乙醚麻醉至大鼠昏迷，足底电击5s）。对照组大鼠单纯性饲养不做任何处理。
3.2 TUNEL方法检测海马神经元凋亡
3.2.1 标本预处理：造模成功后将所有大鼠腹腔注射10%的水合氯醛（0.3mL/100g）麻醉，暴露心脏，用4%多聚甲醛溶液（pH=7.4）250mL灌流固定，直到大鼠四肢僵硬。同时处死对照组和模型组大鼠，剥离脑组织后将脑组织置于10%的中性福尔马林溶液中浸泡过夜。对照大鼠脑组织立体图谱对大鼠海马区进行取材，常规制作石蜡切片。
3.2.2 脱蜡至水：（1）室温下将石蜡组织切片连续两次放入不同的二甲苯中浸泡，每次5min，以脱蜡彻底；（2）依次浸泡于浓度为100%、90%、80%、70%的梯度酒精各1次，每次2min，逐渐增加水分；（3）用PBS浸洗组织切片3次，每次5min，用滤纸小心吸干玻片上多余液体；（4）用疏水笔在组织周围圈出样本分布的轮廓，便于以下过程中组织标本的处理。
3.2.3 增加样本的通透性：用PBS溶液配置终浓度为20ug/mL的蛋白酶K（不含DNase活性），每个样品需要100uL蛋白酶K溶液。在室温下，在每个样本上滴加100uL配制好的蛋白酶K溶液，使蛋白酶K溶液将样本完全覆盖，孵育20min。PBS轻轻润洗组织样本3次，每次5min。然后去掉多余液体，并用滤纸小心吸干在玻片上样品周围的液体。将处理好的样品放置在湿盒中以保持样本的湿润。
3.2.4 配置标记反应液。
3.2.5 标记反应：洗涤样本1次，轻轻吸干样本周围的缓冲液，注意不要触碰到样本。在每个样本上滴加50uL上述配置的标记反应混合物。将切片放置于湿盒中于37℃孵育60～90min。
3.2.6 显色与结果判断：用PBS溶液孵育2次，每次1min，用滤纸吸干栽玻片上样品周围多余液体。室温下，用去离子水浸洗样本2次，每次5min，滴干载玻片上多余的水并用吸水纸擦拭样本周边的区域。用POD稀释液配制POD溶液（1∶25稀释）在每个样本上滴加50uL POD溶液，37℃放置30min。DAB显色液A和B混合稀释成1X工作液。PBS洗涤载玻片3次后，加入50～100uL DAB底物，室温放置10min。PBS洗涤载玻片3次，除去多余底物后，苏木素复染数s，自来水冲洗2min，盐酸酒精分化2s，自来水冲洗2min，室温下依次用50%、70%、85%、95%梯度酒精脱水2min。二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下分析样本。
3.3 海马神经元凋亡率的计算
在400倍光学显微镜下随机取海马区5个不重叠视野，数出相应视野内神经元细胞数和凋亡阳性细胞数。细胞凋亡率=凋亡阳性细胞数/神经元细胞总数。
3.4 统计学处理
统计结果用均数士标准差表示，用SPSS 13.0对两组数据进行t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
4 实验结果
TUNEL阳性细胞核固缩颜色呈黄色或黄褐色，细胞体积缩小，有细胞凋亡的特征。对照组出现较少的神经元凋亡细胞（Ⅰ组9.74+0.88、Ⅱ组9.66+1.23），实验组出现较多的神经元凋亡细胞（Ⅲ组20.1+1.04、Ⅳ组19.7+1.53）。PTSD实验组大鼠TUNEL阳性细胞率明显高于对照组，并具有统计学意义（P<0.05）。见表2：
5 讨论
实验选用成年雄性Wistar大鼠是由于其属于封闭群大鼠，具有无特定病原体、繁殖力强、性格温顺、对传染病抵抗力强、头部较宽阔等特点，有利于饲养、实验操作及结果观察，为PTSD的研究建立接近临床患者情况的动物模型。本实验在SPS之后随即对大鼠进行足底电击是改良后的单一连续应激建模方法，足底电击是将大鼠放在一个有电板的隔离空间内，通过电板导电对大鼠产生电刺激，足底电击可以产生较高强度的应激反应。TUNEL是检测细胞凋亡的常用方法，常用的切片方法为石蜡切片，由于石蜡切片加热操作等过程可导致细胞损伤，增加了细胞凋亡的假阳性，但本实验应用蛋白酶K溶液透明降低了组织样本对TUNEL的敏感性，并且石蜡切片具有可切薄片、易于保存等优点，因此成为实验中应用最普遍的方法之一。
細胞凋亡又称程序性细胞死亡，是一种不同于细胞病理性死亡的生理性变化过程。细胞在发生凋亡时，会在生理生化及细胞形态上发生一系列变化。随着地震、洪水等自然灾害和车祸等人为灾害的增多，创伤后应激障碍越来越多的出现在人类的社会生活之中，但治疗效果一直不容乐观，因而对PTSD发病机制的研究已经成为当今医学界研究的热点之一。有研究表明：PTSD可导致海马区神经元结构及功能发生变化，但机制尚不清楚。多篇研究显示：在PTSD中海马体的损伤及形态结构、细胞学变化与患者及动物模型的病理改变密切相关提示，在PTSD发病过程中，海马部位神经细胞存在凋亡的病理改变。但截止到目前，PTSD详细发病机制仍未被确切阐明。本实验通过TUNEL方法对PTSD大鼠海马区细胞凋亡情况进行检测，结果表明，PTSD大鼠海马神经元细胞凋亡率高于对照组，揭示了海马区神经元细胞凋亡可能与PTSD发病机制有密切关系，为PTSD发病过程中海马区结构及功能变化的机制研究提供实验依据。
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基金项目：华北理工大学科学研究基金项目（Z201344）；华北理工大学大学生创新创业性实验（X2015141）。
作者简介：刘淘（1993-），女，河北邯郸人，华北理工大学临床医学院学生，研究方向：神经病学与精神病学；耿菲（1981-），男，河北唐山人，供职于华北理工大学基础医学院，研究方向：神经病学与精神病学。
（责任编辑：蒋建华）
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