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摘要：以植物乳杆菌、木糖葡萄球菌和戊糖片球菌为发酵菌种，通过制备单一和复合发酵剂，制作发酵鸡肉干。基于对发酵鸡肉干色泽、水分活度、pH、硬度指标的测定，结合顶空-固相微萃取和气相色谱-质谱联用技术对其挥发性化合物进行分析，研究其在品质上的差异，确定出最佳菌种组合。结果表明，发酵剂组鸡肉干的水分活度.pH值均低于对照组;同对照组鸡肉干相比，发酵剂组的L*值均增大，a*值、b*值均只有2组降低。此外，发酵剂组鸡肉干的硬度显著低于对照组（P<0.05），挥发性化合物的种类和相对含量有所增长，结合感官评分来看，3种菌种混合（1：1：1，发酵液体积比）发酵是制作发酵鸡肉干的最佳发酵剂。
关键词：复合发酵剂;发酵鸡肉干;品質特性;风味分析
中图分类号：TS251.4*2
文献标识码：A
文章编号：1000-4440（2019）02-0453-08
鸡肉同牛肉猪肉、羊肉相比，含有较低的脂肪，且肉质细嫩、味道鲜美可口，同时，又因其风味温和、接受性强和易于烹饪加工等原因，深受消费者的喜爱[1]发酵肉干是将发酵技术应用到肉制品，上的一类新型肉类深加工产品，国内外对发酵肉干的研究多基于牛肉、羊肉和鹿肉，而对禽类如鸡肉的研究极少，国内对发酵鸡肉干的研究几乎为空白。人工接种发酵剂进行肉品发酵已成为改良传统发酵肉制品，实现大规模工业化生产的主流做法，可提高产品的安全性、感官品质和益生性[2]。国内外对不同发酵剂在肉制品_上的应用研究十分广泛，如Montanari等[3]研究了清酒乳杆菌和戊糖片球菌对干发酵香肠品质的影响，Di等[4]人研究了乳杆菌代替亚硝酸盐，作为保护性发酵剂抑制发酵猪肉中梭状芽胞杆菌的生长，保护产品安全性。发酵肉制品在内源酶和微生物酶的协同作用下，会在肌肉组织中发生一系列物理生化变化，均会对发酵产品的品质产生影响。
本研究通过探究植物乳杆菌、木糖葡萄球菌、戊糖片球菌的发酵性能，判断其应用在肉制品上的可行性，并以自然发酵为对照，利用单一和复合菌株作为发酵剂制作发酵鸡肉干，探讨不同发酵剂制作的发酵鸡肉干在理化指标和感官指标上的变化规律及差异，筛选出能达到改善发酵鸡肉干嫩度和风味、保证产品安全性等目的的发酵剂组合。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
植物乳杆菌（20265）、戊糖片球菌（20536）、木糖葡萄球菌（21445）均为冻干粉，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。
1.2 仪器与设备
BSP-250型生化培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂生产;T6新世纪紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司生产;TDL-5-A型低速台式大容量离心机，上海安亭科学仪器厂生产;FiveEasy plus型pH计，梅特勒_托利多国际贸易有限公司生产;DP-400型色差仪，柯尼卡美能达公司生产;HD-5型水分活度仪，无锡市华科仪器仪表有限公司生产;TA-XTai型质构仪，英国SMS公司生产;GCMS-QP2010气相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司生产;DB-5MS毛细管柱，美国Agilent Technolo-gies公司生产。
1.3 试验方法
1.3.1 发酵液的特性测定及制备
1.3.1.1 培养基的制备MRS培养基参照王亚男[5]的制备方法，MSA培养基参照张文娟[6]的制备方法，营养琼脂培养基参照何健叶[7]的制备方法，平板计数琼脂培养基参照GB4789.2-2016的制备方法。
1.3.1.2 菌种生长曲线和产酸特性的测定将乳酸菌（戊糖片球菌和植物乳杆菌）、木糖葡萄球菌的冻干粉分别用MRS培养基、MSA培养基于超净工作台中活化2次，以1%的接种量接种到150 ml的培养液中，混匀后分装于试管中放入37oC培养箱中。将新鲜培养基设为对照组，每2h测定试管中菌液的OD600值和pH。
1.3.1.3 菌种拮抗作用的测定参照文献[7]，分别将活化后的菌株在营养琼脂培养基上划1条直线，将培养基置于37oC下培养1d，然后以与菌落生长垂直的方向以画直线的方式再接另一种菌种，注意避开前一种菌种的菌落，在37oC条件下培养1d，取出辨别是否有抑菌圈。
1.3.1.4 活菌计数将1%的活化好的菌种接种至MRS.MSA培养基中，达到对数生长期后，取出后4000 r/min离心10 min，去除上层液，下层沉淀物用10 ml的无菌生理盐水悬浮，参考GB4789.2-2010，用系列稀释和平板计数法进行活菌计数，确认计数结果符合要求后，即得到可用于生产的发酵剂。
1.3.2 发酵鸡肉干的制备工艺流程为：原料肉的选择与预处理→冷冻→切坯→腌制→发酵→烘制→包装→成品。原料肉的选择与预处理：选用新鲜、健康的鸡胸肉为原材料，注意切除脂肪，浸泡并洗净。冷冻：修整后放入冰箱，进行冷冻处理，以便于后续分切。切坯：将鸡胸肉沿肌肉纤维方向切成4.0cmx2.0 cmx0.8 cm的肉条待用，肉条应厚度均匀且整齐。腌制：肉条中加入2.0%葡萄糖、2.5%盐.5.0%料酒、2.0%白胡椒粉、2.0%酱油、1.5%味精，在灭菌玻璃罐中充分搅拌后放入4oC冰箱中腌制5～6h。发酵：腌制结束后，按一定接种比例将1x107CFU/ml的液体发酵剂均匀注射至肉条中，然后放入到温度为30oC的培养箱中43～44 h。烘制：将发酵后的肉条在65oC烘制3 h，95oC烘制1 h，每0.5 h翻1次面，以防止肉干粘连，保证受热均匀。包装、成品：待肉干自然冷却至室温后进行检验，达标后包装即为成品。
分别添加单一和混合菌种（1：1，发酵液体积比）作为发酵剂（1x107 CFU/ml，接入量为2%）制作发酵鸡肉干，以自然发酵剂的鸡肉干为对照，试验设7个处理组，其中，A组为植物乳杆菌，B组为木糖葡萄球菌，C组为戊糖片球菌，D组为植物乳杆菌+木糖葡萄球菌（1：1，发酵液体积比），E组为木糖葡萄球菌+戊糖片球菌（1：1，发酵液体积比），F组为植物乳杆菌+戊糖片球菌（1：1，发酵液体积比），G组为植物乳杆菌+木糖葡萄球菌+戊糖片球菌（1：1：1，发酵液体积比）。
1.3.3 发酵鸡肉干品质测定利用色差仪测定色泽。每个肉样随机测定3个点[8]。利用水分活度仪测定水分。每组样品测定3次[9]称取5g样品，切碎后加入25ml蒸馏水，振荡搅拌15min，然后用pH计进行测定pH值，每组肉样测定3次。利用质构仪测定硬度。测前速：1.0 mm/s，测中速：1.0mm/s，测后速：1.0mm/s，深度：4.0mm探头型号：P/2N[10]挥发性物质利用顶空-固相微萃取和气相色谱-质谱联用技术测定。固相微萃取：取2g切碎的肉样置于20 ml顶空瓶中，水浴（50oC，20 min），然后用SPME针头萃取20 min后直接进样（250oC），解析3min。GC和MS条件：参照丁晔[11]的测定条件。用峰面积归一化法统计挥发性化合物的相对含量。感官评定：选择十名具有食品专业知识储备的老师和同学为感官评定成员，根据感官评分标准表对发酵鸡肉干的形态、色泽、风味、口感（表1）进行评价，结果取平均值。
1.3.4 数据处理用Excel2010对数据进行分析并绘图;用SPSS 20的ANOVA进行方差分析，差异显著水平为P<0.05。
2 结果与分析
2.1 发酵液特性及制备
2.1.1 菌种生长曲线和产酸特性一般来说，菌种活性最强的时期在对数生长末期到稳定期前期[12]。由图1可以看出，植物乳杆菌在培养10 h后达到对数生长期，20 h后进入稳定生长期，从pH来看，培养16～18 h产酸速率最大，然后趋于稳定，这与菌种生长曲线趋势相呼应，在菌种生长代谢旺盛时，其产酸速率随之增大。由图2可以看出，木糖葡萄球菌在培养10 h后达到对数生长期，28h后进入稳定生长期，26h后产酸速率迅速增大，整体产酸要小于其他2种菌种，生产中可与其他菌株复合使用。由图3可以看出，戊糖片球菌在培养8 h后达到对数生长期，16～18 h产酸速率最大，18 h后进入稳定生长期，产酸量在12～24 h不断增加，然后趋于稳定。
可见，3种菌种的最佳收获期为：植物乳杆菌培养16～18 h，木糖葡萄球菌培养26～28 h，戊糖片球菌培养16～18h，此时各菌种的活性最强且产酸适中。
2.1.2 菌种拮抗作用多菌种混合发酵可以丰富产品的风味，从而弥补单一菌种发酵的不足[13]，但细菌在代谢过程中可能會产生细菌素，使与其拮抗的细菌受到抑制，无法正常生长繁殖，影响复合菌种的发酵性能，因此应先确定各菌种是否产生拮抗。由表2可以看出，各菌种互相均无拮抗作用，故可以复配成发酵剂接种到鸡肉中进行发酵。
2.1.3 活菌计数发酵肉的菌种接种量不得小于1x10°CFU/g，才能获得良好的产品品质14。本研究中各菌株的活菌计数结果分别为，植物乳杆菌（94+6）x108 CFU/ml;木糖葡萄球菌（32+4）x107CFU/ml;戊糖片球菌（76±6）x108 CFU/ml。计数结果满足发酵肉菌种接种量的要求，说明试验所用的3种菌种可用于发酵肉的生产。
2.2 发酵鸡肉干品质特性
2.2.1 色泽的测定由表3可以看出，同对照组相比，各发酵剂组的L*值均增大，说明添加发酵剂可以提高鸡肉干的亮度，除B组外，其余各发酵组的L*值与对照组相比均呈显著性差异（P<0.05），其中，F组的L*值最大为48.72，说明添加植物乳杆菌+戊糖片球菌（1：1，发酵液体积比）混合菌种有助于发酵鸡肉干亮度的显著增加。同对照组的a"*值相比，除了E组和G组显著降低外（P<0.05），其余各发酵组的变化均不显著（P>0.05），说明添加木糖葡萄球菌+戊糖片球菌（1：1，发酵液体积比）混合菌种、植物乳杆菌+木糖葡萄球菌+戊糖片球菌（1：1：1，发酵液体积比）混合菌种不利于发酵鸡肉干红度的增加，这可能是由于乳酸菌在生长代谢时会产生H2O2，可以分解亚铁血红素，使红度降低，而只有B组的a*值高于对照组，说明添加木糖葡萄球菌单菌具有提高发酵鸡肉干红度的特性，这与夏秀芳等[15]的研究结果相同，他们研究了不同木糖葡萄球菌接种量对发酵牛肉串品质的影响，结果表明接种木糖葡萄球菌的肉串其a*值高于未接种菌种的空白组，即木糖葡萄球菌的加入可以改善发酵肉制品的红度。同对照组的b*值相比，D组和F组略有下降且差异不显著（P>0.05），其余各发酵组均升高，说明这些发酵组的发酵剂具有增加发酵鸡肉干黄度的能力。综合来看，添加外源菌种有改善发酵肉制品色泽品质的作用。
2.2.2 水分活度由图4可以看出，各发酵剂组的水分活度值均小于对照组，说明接入发酵剂可降低鸡肉干中的水分。其中A组、B组、D组与对照组差异显著（P<0.05），说明植物乳杆菌、木糖葡萄球菌单菌及二者的复合发酵剂均可显著降低鸡肉干的水分活度（P<0.05）。常见食源性致病菌如李斯特菌和大肠杆菌等在低水分活度条件下受到显著抑制[，因此，发酵后的鸡肉干具有较高的安全性和耐贮性。
显著低于对照组（P<0.05），其中，F组pH值最低（P<0.05），说明添加植物乳杆菌+戊糖片球菌（1：1，发酵液体积比）可显著降低鸡肉干的pH值，低酸环境有利于鸡肉中的蛋白质、脂肪等物质发生物理、化学的分解反应，提高产品的风味品质，产生多种利于人体消化吸收的氨基酸和脂肪酸，同时，低pH值还可抑制腐败菌和致病菌的繁殖进而降低细菌毒素的产生[13]
2.2.3 pH 值由图5可以看出，各处理组的pH值
2.2.4 硬度硬度指使物体变形或被穿透所需的力，是食品维持其形状的内部结合力[16]。由图6可以看出，各发酵组的硬度显著低于对照组（P<0.05），各发酵剂组间差异显著（P<0.05），说明发酵剂的添加可显著降低鸡肉干的硬度，这是因为这3种菌种都能产生蛋白酶，可促使鸡肉中肌浆蛋白与肌原纤维蛋白的分解，破坏肉产品内部的结合力，使其质地变得柔嫩，方便咀嚼，改良了传统肉干干硬的缺点。
2.2.5 挥发性物质通过SPME-GC-MS检测8种样品一共分析得到118种挥发性化合物，分别为烯烃类31种、杂环化合物30种、烷烃14种、酯类13种、醇类12种、酮类7种、醛类6种、酸类3种、酚类1种、醚类1种。
由表4可以看出，对照组、A组、B组、C组、D组、E组、F组、G组分别检出32、36、34、35、35、32、3333种挥发性物质，除E组外，其余各处理组挥发性化合物种类均高于对照组，其中，烯烃类、醇类化合物种类明显增加，除了β-月桂烯、D-柠檬酸、庚醛、松油烯-4-醇等各组均有的化合物外，处理组还出现了对照组未检出的化合物，如：芳樟醇、2，6-二甲基-4-庚酮、辛酸乙酯、辛醚等。
另外，各发酵剂组的挥发性化合物总相对含量均高于对照组，其中，除醛、酮、酚、酸类化合物有所降低外，烯烃类、醇类增加较多，说明同对照组相比，发酵剂组在经过发酵后可以增加鸡肉干的挥发性物质，这是由于在发酵肉制品的成熟过程中，在菌体生长代谢和外界环境因素的共同作用下，肉中的蛋白质、脂类和碳水化合物发生降解，脂肪分解的游离脂肪酸和蛋白质分解的游离氨基酸可以作为风味成分的前体物质，经过复杂的酶促反应和非酶促反应，产生多种挥发性化合物，如醇、醛、酮、酯、羧酸、吡嗪及某些含硫、含卤素的物质等，直接影响产品的风味。产品的最终风味品质取决于不同挥发性化合物的种类、含量和阈值[17]。烯烃类在各发酵剂组中的相对含量最高，均高于40%，多来源于调味的香辛料，如胡椒会产生3-蒈烯、β-蒎烯、月桂烯等特殊的风味，石竹烯具有辛香、药草味道[18]，a-水芹烯具有黑胡椒和薄荷香气[19]，发酵剂组烯烃类化合物的增加说明发酵作用可提高香辛料中的挥发性化合物，唐鑫等[20]用植物乳杆菌和酵母菌发酵辣椒汁，测定挥发性成分也发现烯烃类的相对含量有所增加。还原糖和氨基酸两者间发生的美拉德反应会产生杂环化合物，多具有肉类特有的香气，检测出吡嗪类、芳香烃类化合物的相对含量较高，这2种化合物的阈值较低，具有特殊香气，如2，5-二甲基吡嗪具有马铃薯片香味[21]。阈值普遍偏高的烷烃类化合物对风味的改良能力弱，但却是合成某些大分子物质的基础。酯类物质阈值偏低，被认为是发酵香肠香味的主要提供者[22]。醇类物质中，不饱和醇对肉制品的风味有一定贡献，如检出的化合物中含量较高的物质松油烯-4-醇具有胡椒香[21]。酮类大多阈值高，对风味的呈现贡献低[23]，但部分酮類可作为中间物质有助于形成杂环化合物，对肉味的形成仍有不可或缺的作用。醛类物质具有甜香味和水果香[24]，对发酵肉风味的贡献较大，检测出的壬醛和庚醛含量较高，有研究结果表明耗牛肉经微波加热后也产生了高含量的这2种醛类物质，它们是熟牦牛肉的特征风味[25]。酚类物质阈值较低，是构成烟熏肉制品独特风味的重要成分[26]。醚类、酸类的相对含量较少，对风味的贡献不大。
2.2.6 感官评定由图7可以看出，同对照组相比，各处理组的感官评分值均增大，说明菌种的发酵作用可提高鸡肉干的感官品质，且C组、D组、E组、F组、G组均显著高于对照组（P<0.05），而这5组组间的差异不显著（P>0.05），G组的感官评分值最高为89分。表明，加入适宜适量的菌种可以提高发酵鸡肉干的综合感官品质。
3 讨论
植物乳杆菌、木糖葡萄球菌、戊糖片球菌分别在培养至10h、10h、8 h时进入对数生长期，植物乳杆菌戊糖片球菌的菌种最佳收获期均为16～18 h，产酸性强，木糖葡萄球菌在26～28h达到最佳收获期，但产酸性差。发酵剂组鸡肉干的水分活度均低于对照组，发酵剂组的pH值显著低于对照组（P<0.05），低水分活度可以抑制腐败菌的繁殖，同时，低pH值还可阻止致病菌的生长。发酵剂组鸡肉干的色泽测定结果中，同对照组相比，L*值均增大，a*值只有2组显著降低（P<0.05），b*值只有2组略有下降。发酵剂组的硬度较对照组显著降低（P<0.05），挥发性化合物的种类和相对含量也有所增长：对照组、A、B、C、D、E、F、G组分别检出32、36、3435.35.3233.33种挥发性化合物。
综合来看，植物乳杆菌、木糖葡萄球菌、戊糖片球菌可以作为鸡肉干发酵剂来提高鸡肉干的品质，添加3种菌种混合发酵剂制得的鸡肉干各项测定结果较好，且感官评分值最高，是发酵鸡肉干的最佳组合。
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