材料与方法
1.1 细菌与质粒
限制性内切酶、dNTP Mix、高保真酶rTaq、pMD-18T载体和T4 DNA连接酶，购自宝生物工程（大连）有限公司；质粒DNA小量提取试剂盒，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；大肠杆菌DH5α为湖北省农业科学院畜牧兽医研究所生物技术室存留；MLM3613和pDR274载体购自美国Addgene公司；体外转录试剂盒mMessagemMachine T7购自Ambion公司，SURVEYOR突变检测试剂盒购自Transgenomic公司。
1.2 靶位点设计
从NCBI（http：//archive-dtd.ncbi.nlm.nih.gov/）获得小鼠MSTN基因组序列，利用ZiFit软件预测靶位点，选取其中的3个位点。
1.3 Cas9 mRNA的体外转录和加尾
1.3.1 Cas9表达载体线性化 Cas9表达载体MLM3613提纯后用PmeⅠ酶切线性化。利用PCR产物纯化试剂盒回收线性化片段；向回收产物中加入2倍体积无水乙醇和1/10体积NaAc，-20 ℃放置过夜后高速离心回收产物，无RNA酶水溶解产物浓度至500～1 000 ng/μL，-20 ℃保存备用。
1.3.2 体外转录 利用Ambion公司mMessagemMachine T7 试剂盒进行Cas9 mRNA的体外转录和polyA加尾。20 μL体外转录体系为：2 μL线性化质粒DNA（1 μg），10 μL 2×NTP/CAP， 2 μL 10×Reaction Buffer，2 μL Enzyme mix，4 μL ddH2O，混匀后37 ℃反应2 h。80 μL polyA加尾体系为：20 μL 5×EPAP Buffer，10 μL MgCl2（25 mmol/L），10 μL ATP（10 mmol/L），4 μL E-PAP，36 μL ddH2O，混匀后37 ℃反应30 min。以1%琼脂糖凝胶检测RNA转录和加尾情况。
1.4 gRNA编码载体构建及体外转录
根据软件预测的3个靶序列分别合成序列互补的正、反向引物，在正向引物5’端合成TAGG接头，在反向引物5’端合成CAAA接头，设计模式如图1所示，合成3个靶序列引物如表1所示。
gRNA体外转录载体pDR274载体购自Addgene公司（Addgene No. 42250），将该载体用Bsa Ⅰ酶切线性化后回收，与上面得到的双链产物进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α后提取质粒进行鉴定。将阳性质粒大量提取后用Dra Ⅰ内切酶线性化并回收线性化产物，浓缩浓度至500～1 000 ng/μL，-20 ℃保存备用。
1.5 小鼠胚胎注射
选取4～5周龄母鼠作为受精卵供体，腹腔注射PMSG和hCG进行超数排卵，交配后取细胞期胚胎进行显微注射。将Cas9 mRNA（100 ng/μL）和sgRNA（100 ng/μL）混合均匀，注射到细胞期胚胎的胞质内，注射后的胚胎移植到假孕母鼠的输卵管内。
1.6 敲除小鼠检测
待移植后的胚胎发育到13 d时，取出胚胎提取基因组DNA进行错配内切酶鉴定。具体步骤为：提取基因组DNA，设计引物扩增出靶序列两侧共350 bp片段，纯化PCR产物；将纯化的PCR产物在95 ℃变性10 min，之后缓慢降温至室温使片段重新退火，降温程序为95℃→85 ℃（每秒降温2 ℃），85 ℃→25 ℃（每秒降温0.5 ℃）；重新退火的PCR产物用2 U的T7EI在37 ℃酶切3 h，然后1%琼脂糖凝胶电泳检测结果。
2 结果与分析
2.1 Cas9表达载体构建与线性化
Cas9表达载体MLM3613质粒经PmeⅠ酶切得到7.5 kb线性化片段（图2），乙醇沉淀浓度达到1 000 ng/μL，纯度高，可以用于下一步体外转录试验。
2.2 Cas9 mRNA体外转录结果
Cas9表达载体经酶切线性化后，通过ABI公司的体外转录试剂盒进行转录，得到了带有帽子结构的Cas9 mRNA，并通过酚仿抽提得到纯化的mRNA。结果（图3）表明，转录的mRNA呈现明显的两条带，为RNA的不同结构，纯度较高，可用于下一步加尾试验。
2.3 加polyA尾后得到全长mRNA序列
将体外转录出的mRNA通过polyA Tailing Kit试剂盒进行加尾，加上长度约150 bp的polyA尾巴，使之成为完整的有功能的mRNA。结果（图4）表明，加尾后的mRNA在电泳时出现了适当的滞后，polyA加尾成功。
2.4 敲除小鼠检测
待孕母鼠怀孕13 d时取出30只胚胎，提取其基因组DNA。用Transgenomic公司的SURVEYOR突变检测试剂盒进行突变检测。结果表明，PCR扩增出T1靶位点两侧473 bp序列，靶序列两侧序列分别为322 bp和151 bp。当序列内部存在碱基突变时，退火后形成的杂合双链能够被酶切开，形成3条带（图5样品10）；当不存在碱基突变时，退火形成的双链不存在碱基错配，不能被酶切开，30个样品中共检测出2只为突变阳性。
3 小结与讨论
本研究获得的Cas9和gRNA表达载体，为下一步进行相关研究提供了试验材料；建立了CRISPR/Cas9基因定点修饰技术平台，为转基因小鼠和转基因猪的制备奠定了技术基础，通过CRISPR/Cas9系统获得了MSTN基因敲除小鼠。
基因敲除动物模型一直是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、技术要求高，而且费用大、耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上时间。本研究通过体外转录和显微注射等方法在较短时间内获得了MSTN基因敲除的小鼠，从时间、成本等方面节约了大量资源，也为下一步进行大动物转基因研究奠定了基础。但是从检测的结果来看，效率并不高，30只小鼠中只检测到2只阳性。分析原因可能是：①RNA显微注射过程中RNA降解问题。RNA很不稳定，容易受到外界环境中RNA酶的降解而失效，在进行中RNA裸露在环境中的时间较长，且温度无法控制到很低，导致RNA降解严重；②检测方法灵敏度较低。本研究应用的是SURVEYOR检测方法，该方法对试验条件要求特别严格，酶添加量及酶切时间长短都会严重影响试验结果，导致试验结果不稳定，重复性差，只能通过大量克隆测序来解决。
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