[摘要] 目的 探讨低能量激光联合环磷酰胺（CTX）对小鼠肿瘤增殖及血管新生的影响。 方法 建立荷瘤小鼠模型，随机将40只荷瘤小鼠分为生理盐水对照组（NS组）、低能量激光照射组（JG组）、环磷酰胺组（CTX组）、低能量激光联合环磷酰胺组（JG+CTX组），每组各10只。分别给予相应药物或激光治疗连续10 d。观察肿瘤生长情况，测量荷瘤小鼠的瘤质量、脾质量，计算抑瘤率及脾指数；原位杂交法检测瘤组织血管内皮生长因子（VEGF）mRNA表达，免疫组化方法检测瘤组织微血管密度（microvessel density，MVD）及增殖细胞核抗原（PCNA）的表达情况。 结果 ①NS组小鼠给药第7、10天体重[（23.24±0.60）、（26.79±0.59）g]低于JG组[（26.74±1.23）、（26.79±0.59）g]、CTX组[（25.55±0.71）、（25.69±0.35）g]、JG+CTX组[（26.09±0.68）、（26.41±0.67）g]，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）；JG组、CTX组和JG+CTX组抑瘤率分别为（50.82±0.33）%、（65.57±0.24）%、（53.69±0.33）%；JG组、JG+CTX组的瘤质量[（1.20±0.43）、（1.13±0.43）g]低于NS组[（2.44±0.23）g]，JG组、JG+CTX组的脾指数[（14.30±0.20）、（14.51±0.16）‰]高于NS组[（9.96±0.18）‰]，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。②JG组、CTX组、JG+CTX组VEGF mRNA平均灰度[（62.28±2.36）、（68.12±2.60）、（69.95±4.38）]低于NS组（49.87±3.76），差异有高度统计学意义（P < 0.01）；JG组VEGF mRNA平均灰度低于与JG+CTX组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；JG+CTX组VEGF mRNA平均灰度与CTX组比较，差异无统计学意义（P = 0.234）。NS组MVD值（14.57±0.58）高于JG组（13.52±0.33）、CTX组（12.30±0.29）、JG+CTX组（11.49±0.44），差异有高度统计学意义（P < 0.01）；JG+CTX组MVD值低于JG组、CTX组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。③NS组PCNA阳性细胞数[（80.6±2.01）个]高于JG组[（73.8±2.57）个]、CTX组[（63.7±2.75）个]、JG+CTX组[（66.1±3.38）个]，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；CTX组与JG+CTX组PCNA阳性细胞数差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 低能量激光对小鼠移植瘤具有一定的生长抑制作用，联合环磷酰胺可明显抑制肿瘤细胞的增殖及血管生成，具有协同抗肿瘤作用。
[关键词] 肝癌；低能量激光；环磷酰胺；血管新生；增殖细胞核抗原
[中图分类号] R730.57 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）05（c）-0034-04
复发和转移一直是困扰临床医生的重大问题。放疗和化疗出现的严重毒副作用，使得治疗效果不尽人意。血管生成在肿瘤增殖中起着重要作用，而生物学治疗给人类带来了新的希望，目前用激光生物学疗法治疗疾病已成为国内外学者研究的热点。本研究通过分析低能量激光照射与环磷酰胺（CTX）联合应用对肿瘤细胞增殖及血管生成的影响，探讨可能的抑瘤机制，以期对肿瘤治疗开拓新的研究方向。
1 材料与方法
1.1 实验试剂及设备
CTX由江苏恒瑞医药股份有限公司提供，批号05010821；血管内皮生长因子（VEGF）mRNA原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物制品公司；增殖细胞核抗原（PCNA）单克隆抗体、免疫组化SP检测试剂盒购自福建迈新生物技术开发有限公司；肝癌细胞H-22株由北京大学肿瘤研究所引进；JD-Ⅲ型激光治疗机为南京医用激光仪器厂生产。
1.2 实验动物
KM小鼠43只（其中3只进行种植瘤培养），购自内蒙古大学动物实验中心，许可证号：SCXK（蒙）2009-0001，体重18～22 g，雌雄各半。
1.3 实验方法
1.3.1 模型建立 3只KM小鼠腹腔注射0.5 mL肝癌细胞H-22株进行培养，1周后取腹水生长良好的小鼠无菌条件下取腹水10 mL，置冰盒内，用生理盐水按1∶2稀释成细胞悬液，调节细胞浓度为2.5×107细胞/mL，按0.2 mL/只接种于小鼠右腋部皮下，制成荷瘤小鼠模型。
1.3.2 动物分组 40只KM小鼠接种肿瘤细胞4 h后，随机分为4组，每组各10只。①生理盐水（NS）组：NS 20 mL/（kg·d）灌胃。②低能量激光照射组（JG组）：激光照射小鼠脾区。③环磷酰胺组（CTX组）：15 mg/（kg·d）灌胃。④低能量激光照射联合环磷酰胺组（JG+CTX组）：激光照射小鼠脾区联合CTX 15 mg/（kg·d）灌胃。
1.3.3 激光照射 激光仪输出光波功率12 mW，激光波长632.8 nm，光斑直径0.6 cm，照射剂量25.48 J/cm2。接种肝癌细胞H-22株24 h后JG组和JG+CTX组用激光照射小鼠，部位为脾区，激光照射经过扩束后垂直距离30 cm，照射10 min/（次·d）。各用药组于接种24 h后开始给药，连续10 d后处死小鼠。
1.4 标本采集及观察指标
1.4.1 一般情况观测 小鼠皮下接种肝癌细胞H-22株分组后称量各组初始体重。小鼠接种肝癌细胞H-22株后成瘤率为100%，每天观察小鼠的饮食、活动、毛色等一般情况的变化，每3天测量体重1次。以用药时间（d）为横轴，各组体重均值（g）为纵轴描记各组小鼠的体重变化趋势曲线。
1.4.2 抑瘤率及脾指数照射 给药结束后第2天处死小鼠，测量荷瘤小鼠的体重，然后迅速将肿瘤组织完整剥出，称重、计算抑瘤率；摘取脾脏，称重、计算脾指数，公式如下：
抑瘤率=[（NS组平均瘤重-干预组平均瘤重）/NS组平均瘤重]×100%。脾指数=脾脏重（mg）/体重（g）。
1.4.3 原位杂交法检测瘤细胞VEGF mRNA表达肿瘤组织 称重后，将肿瘤组织置于10%中性甲醛中固定，常规石蜡包埋，5 μm切片，使用VEGF mRNA原位杂交检测试剂盒，检测肿瘤VEGF mRNA。NS组用磷酸盐缓冲液（PBS）代替原位杂交探针，结果肿瘤细胞中无阳性表达，提示本实验检测VEGF mRNA是特异性表达。在图像分析系统下观察各组瘤细胞VEGF mRNA表达。
1.4.4 肿瘤微血管密度（microvessel density，MVD）的检测 免疫组化SP法染色血管，经染色后内皮细胞褐染，血管呈黄褐色，易于辨认。先在低倍视野下选取肿瘤内新生血管最丰富的区域，即“热点”，然后在200倍视野范围，计数被染成棕色的微血管数目，取5个视野的平均值作为MVD值。
1.4.5 瘤组织增殖细胞核抗原PCNA表达 采用免疫组化SP法检测，按照试剂盒说明书进行操作。每个标本切片低倍视野下观察，确定有代表性的PCNA染色阳性部位，选择5个视野，400倍镜下每个视野选取200个肿瘤细胞，观察并计算阳性细胞总数。细胞核着色呈棕褐色或棕黄色为阳性细胞，PBS为一抗的阴性对照片无棕黄色染色。
1.5 统计学方法
采用统计软件SPSS 15.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组一般情况与体重变化比较
各组小鼠鼠给药第1天体重差异无统计学意义（P = 0.177）；NS组小鼠给药第7、10天体重低于JG组、CTX组、JG+CTX组，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01），小鼠饮食差、活动减少，闭目打盹，呈消耗状态；JG组、JG+CTX组小鼠均活动灵活，体表毛色光泽度好，在10 d内体重均呈增加趋势，与NS组动物相比生存质量明显改善；CTX组用药后小鼠体重平均值在第1周增加明显，1周后体重变化不明显，但出现精神萎靡、行动迟缓、饮水进食量下降，提示出现一些毒副作用。见表1。
2.2 各组瘤重量、抑瘤率、脾重、脾指数变化
JG组、CTX组、JG+CTX组的抑瘤率分别为抑瘤率分别为（50.82±0.33）%、（65.57±0.24）%、（53.69±0.33）%。JG组、JG+CTX组的瘤质量低于NS组，JG组、JG+CTX组的脾指数高于NS组，差异均有统计学意义（均P < 0.05或P < 0.01）；说明在抑制肿瘤的同时，也在一定程度上增强了免疫系统功能；CTX组抑瘤率虽高但脾指数与NS组比较，差异无统计学意义（P > 0.05），表明CTX尽管能限制肿瘤生长，但同时抑制了系统免疫功能。见表2。
2.3 各组瘤组织中VEGF mRNA平均灰度、MVD比较
原位杂交结果显示，JG组、CTX组、JG+CTX组VEGF mRNA平均灰度低于NS组，差异有高度统计学意义（P < 0.01），表达均明显下降；JG组VEGF mRNA平均灰度低于与JG+CTX组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；JG+CTX组VEGF mRNA平均灰度与CTX组比较，差异无统计学意义（P = 0.234）。见表3。
微血管染色结果显示，NS组MVD值高于JG组、CTX组、JG+CTX组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；JG+CTX组MVD值低于JG组、CTX组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表3。
2.4 各组及PCNA阳性细胞数比较
免疫组化法检测结果显示，PCNA定位于细胞核，染色呈棕褐色或棕黄色为阳性细胞。NS组PCNA阳性细胞数高于JG组、CTX组、JG+CTX组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；CTX组与JG+CTX组PCNA阳性细胞数差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。
3 讨论
近年来，国内外的激光医学研究在免疫学的应用已取得显著成效，低能激光照射的免疫学调节效应已经得到公认，但这种效应的表现形式是受诸多因素如动物种类、照射剂量、照射时间及照射部位等影响的。总体上说来，激光照射免疫器官，或该处神经组织密度较高，那么对机体免疫功能影响就越为明显[1-3]。研究激光特性及其与生物组织相互作用的机制，有助于进一步探讨激光的生物学效应，并可为临床应用激光治疗疾病提供依据。
恶性肿瘤在生长过程中，由于组织增生过快必然会造成局部组织严重缺氧和供能与耗能之间的不平衡。肿瘤细胞适应缺氧的重要机制之一是新生血管体系形成，肿瘤血管形成在肿瘤的演化过程中起到非常重要的作用，是恶性肿瘤生长和远处转移的前提条件。VEGF被认为是最重要的促血管生成因子，同时也是高度特异和有效的血管生成调控因子，多种肿瘤细胞分泌VEGF，诱导肿瘤血管新生，与肿瘤的生长、远处转移高度相关[4]。VEGF能与血管内皮细胞膜上的选择性酪氨酸激酶受体结合，通过诱导内皮细胞产生蛋白溶解酶、诱导间质中胶原酶和组织因子（TF）的表达，改变细胞外基质，使其更易于血管的生长；并可促进血管内皮细胞分裂、增殖，提高微血管壁对大分子物质的通透性[5-6]。同时进行肿瘤血管定量检测，可计数MVD来反映血管生成活性[7-8]，本实验通过原位杂交法检测荷肝癌小鼠瘤细胞VEGF mRNA表达情况，结果JG+CTX组与NS组比较，VEGF mRNA表达明显减弱（P < 0.01），表明低能量激光照射联合CTX可以通过抑制肿瘤细胞中VEGF的生成，导致血管新生受到抑制，阻断肿瘤生长所需营养，最终达到抑制肿瘤生长、侵袭、远处转移的目的。
目前使用较多的增殖细胞标记抗原有PCNA、Ki67等，PCNA只存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞内。研究发现，PCNA参与了细胞DNA损伤修复、细胞周期转换调控、染色体重组、DNA甲基化等，反映肿瘤细胞的代谢和DNA、RNA的合成状态，与多种肿瘤的分化、浸润、淋巴结或脏器转移、肿瘤复发等有关[9]。它在固定的肿瘤组织S期中能较长时间被保存下来，是一种很好的判断细胞增殖情况的标记[10]，其表达率越高，表明肿瘤细胞的增殖越活跃[11]。本实验通过免疫组化法检测各组瘤细胞的PCNA阳性表达细胞数来反映瘤组织增殖情况，结果表明，NS组PCNA阳性细胞数高于JG组、CTX组、JG+CTX组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；CTX组与JG+CTX组PCNA阳性细胞数差异无统计学意义（P > 0.05）。提示未给予任何抗肿瘤治疗干预的NS组，肿瘤细胞的PCNA增强，表明细胞增殖活性增高，瘤组织生长旺盛。低能量照射和CTX能使肿瘤细胞PCNA表达减弱，肿瘤增殖受到抑制，组织中增殖细胞减少，导致肿瘤的生长被抑制。
低能量激光照射联合CTX能够通过减少肿瘤血管新生，抑制肿瘤细胞增殖。关于激光和其联合药物的抑瘤作用研究虽然有了一定进展，但这方面的研究还不够深入，许多问题还有待于进一步的研究。
[参考文献]
[1] 高美华，李武修，冯献启，等.激光照射对荷瘤小鼠淋巴细胞活性的影响[J].中国激光，2002，4（29）：381-382.
[2] 史瑞新，周延民，陈远萍.低能量激光照射对受张力刺激的成骨细胞周期和细胞凋亡的影响[J].中国老年学杂志，2011，5（31）：839-841.
[3] 李仙峰，崔明玉，崔珈衔，等.氦氖激光联合黄芪注射液对小鼠骨髓造血细胞的影响[J].内蒙古医学院学报，2011，33（3）：193-196.
[4] 肖建新.恶性肿瘤微血管形成与肿瘤转移[J].中国实用医药杂志，2010，5（9）：64-65.
[5] 张巍，孙迎春，陈萍，等.TMCP-1和VEGF在卵巢癌中的表达及临床意义[J].中国老年学杂志，2010，15（30）：2104-2105.
[6] Shimamura T，Saito S，Morita K，et al. Detection of vascular endothelial growth factor and its receptor expression in human hepatocellular carcinoma biopsy specimens [J]. J Gastroenterol Hepatol，2000，15（6）：640-646.
[7] Yang ZF，Poon RT. Vascular changes in hepatocellular carcinoma [J]. AnatRec（Hoboken），2008，291（6）：721-734.
[8] Roberta P，Ronnie TP. Angiogenesis and antiangiogenic therapy in hepatocellular carcinoma [J]. CancerLetters，2006，242（2）：151-167.
[9] 刘伟伟，吕秀萍，胡明英，等.卵巢癌组织中PCNA、Ki67的表达变化及意义[J].山东医药，2010，50（26）：33-34.
[10] Venturi A，Piaz FD，Giovannini C，et al. Human hepatocellular carcinoma expresses specific PCNA isoforms：an in vivo and in vitro evaluation [J]. Lab Invest，2008，88（9），995-1007.
[11] Mun KS，Cheah PL，Baharudin NB，et al. Proliferating cellnuclear antigen（PCNA）activity in hepatocellular carcinoma，benign peri-neoplastic and normal liver [J]. Malays J Patho，2006，28（2）：73-77.
（收稿日期：2013-02-04 本文编辑：李继翔）
相关热词搜索： 小鼠 增殖 肿瘤 血管 酰胺
