实时荧光定量PCR技术研究进展及应用

作者单位：473058河南省南阳医学高等专科学校第一附属医院检验科

1 研究进展

二十多年前，美国Perkin-Elmer Cetus公司人类遗传研究室Mullis等发明了聚合酶链反应(PCR)技术，这成为20世纪生物医学领域革命性创举与里程碑，使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。几年后，世界生物实验室中，PCR技术占据了统治地位，并成为分子生物领域的关键技术。大量特异性PCR产物的生成使许多新的DNA分析方法的使用成为可能，这些分析方法包括下游修饰或互补性产物分析技术。但是，利用传统的PCR技术进行检测鉴定时，需要将扩增反应后的电泳进行分离及染色处理，且不能准确定量，使其应用受到限制。1992年，Higuchi最早提出了实时PCR的设想，它的基本思想是利用荧光染料EB(溴化乙锭)可以插入到双链核酸中受激发光的性质，在PCR反应的退火或延伸时检测掺入到双链核酸中EB的含量就能实时监控PCR反应的进程，根据PCR反应的数学函数关系，结合相应的算法，通过加入标准品的方法，就可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。但Higuchi利用的是嵌入荧光染料检测，它只能简单地反映PCR反应体系中总的核酸量，是一种非特异性的检测方法。直到1995年，美国PE公司研制成功具有革命性意义的荧光定量PCR技术，融合了PCR高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化，以获得特定区段扩增产物定量的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，完全闭管操作，克服了常规PCR技术的诸多难题。1996年美国Applied Biosystems公司推出了成熟的实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction.FQ-PCR)技术。实时荧光定量PCR技术的出现，标志着DNA分析领域的又一次革命性飞跃。这种先进技术，是在原PCR方法基础上的又一次进展，使高效的DNA定量、定性分析，以及高灵敏性DNA扩增成为可能。这种创新性的PCR技术可以对DNA扩增过程进行监测。

在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-Ct值。C代表Cycle(循环)，t代表threshold(阈值)，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。FQ-PCR是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板的定量及定性分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。实时荧光定量PCR监测需要专有仪器，能够通过联机收集每个扩增周期的数据。实时荧光定量PCR仪器通过DNA分子中的荧光染色情况进行PCR扩增产物测定。每个PCR扩增周期的扩增产物的荧光测定结果显示为点状曲线。一般而言，荧光扩增曲线可分为三个典型时期：早期背景扩增期、中期指数扩增期以及晚期的平台期。PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15个循环荧光信号标准偏差的10倍。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，只要获得未知样品的Ct值即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

实时荧光定量PCR仪可以使研究人员对DNA扩增情况进行密切监测，间接通过荧光信号测定，观察PCR产物累计情况。

实时荧光定量PCR方法有很多类型及亚型，每种方法均具有特有条件、复杂性及可靠性。所有这些实时荧光定量PCR方法均可按照定量方法被分为两种类型-绝对及相对定量。监测方法选择取决于分析复杂性以及最终结果。

绝对定量可对单一靶序列进行定量检测。检测结果为绝对值(例如：病毒载量copies/ml)。绝对定量FQ-PCR一般采用外标准品定量的制备来实现绝对定量，可以通过化学合成目的基因；或是将PCR扩增产物直接梯度稀释，或是将PCR产物克隆到载体上，然后抽提出质粒，经过测量浓度和拷贝数可准确定量，它的优点是稳定、准确。质粒DNA和体外转录的RNA常作为绝对定量的标准品。将标准品稀释成不同浓度的样品，并作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线。对未知样品进行定量时，根据未知样品的Ct值，即可在标准曲线中定出样品的拷贝数。做好标准曲线至关重要，对于RNA样品，标准品最好是体外转录的RNA，如果用cDNA、PCR产物作为标准品，虽然制备简单易于保存，但是将会因为标准品无法准确指示样品反转录效率，而给最终定量起始拷贝数带来影响。绝对定量也具有相应的缺陷，标准品的稳定保存很难获得成功。目前广泛使用的在260 nm波长下定量的方法与众多因素有关，如水、缓冲液、仪器性能，乃至于核酸的抽提过程都会影响到结果的稳定性。这种分析通常见于研究领域像病毒学与微生物学领域。

相对定量是单一样本中两种不同靶序列浓度比较，检测结果是靶基因比值。相对定量是指在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因，该管家基因主要是用于核苷酸拷贝数的比较、反映体系内是否存在PCR扩增的影响因素，通常选用的管家基因有GAPDH、β-2微球蛋白和rRNA。使用的β-actin、相对定量较为早期的方法是用一系列已知外参物做标准曲线，根据该标准曲线得到目的基因和管家基因的量，再将目的基因同管家基因的比值作为定量的最后结果。此种方法计算出未知样品的量是相对于某个参照物的量而言，因此，相对定量的标准曲线比较容易制备，对于所用的标准品只需知道其稀释度即可。在整个试验中，待测样品的量来自于标准曲线，最终必须除以参照基因的量，即参照基因是1 的样本，其他的样本为参照基因的n倍。由于管家基因在各种组织中的恒定表达，所以可用管家基因的量来作为标准，以比较来源不同的样本，目的基因表达量的差异，此即相对定量。这一方法的缺陷是要求外参、目的基因和管家基因的扩增效率一致。此外加入已知起始拷贝数的内标相当于是进行双重PCR反应，存在两种模板相互的干扰和竞争。

2 实时荧光定量PCR技术的医学应用

实时荧光定量PCR的应用范围很广泛，已广泛应用于临床及生命科学研究的各个领域中。在科研方面可定量分析各种基因的表达分析，基因突变和多态性分析，单核苷酸多态SNP测定及易位基因的检测；在医疗方面可用于免疫组化分析、临床疾病早期诊断、病原体检测、耐药性分析、肿瘤微小残留病变研究等。

肿瘤微小残留病变的检测：肿瘤的本质是细胞内基因发生了变化，是一种多基因异常的疾病，这些异常变化用实时荧光定量PCR方法都可以检测出来。肿瘤疾病尤其是血液的恶性肿瘤常伴有特异性基因的易位，这种易位往往可以作为监测临床治疗效果的一种肿瘤标志。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病ER基因、肿瘤MDRl基因等，尽管肿瘤发病的分子机制尚未完全阐明，但相关基因的遗传学改变的积累是致癌性转变的根本原因之一已得到普遍承认。癌基因的突变和表达增加，在许多肿瘤早期就出现。实时荧光PCR技术不仅能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。如定量结直肠癌淋巴结的癌胚抗原(CEA)mRNA的表达量，可作为诊断癌症微转移的重要依据。虽然在过去的几十年里，治疗方案的改进已明显地延长了患者的生存期，但是缓解期的患者仍存在复发的危险性。因此微小残留病变的检测对于进一步调整治疗方案是至关重要的。实时荧光定量PCR的应用正成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备研究工具。通过对肿瘤融合基因的定量测定能指导临床对患者实行个体化的治疗。目前的研究证明用实时荧光定量PCR来检测融合基因有助于对这些患者的微小残留病变进行定量，其作为预后的指标或对治疗方案的评估是有价值的。同样的方法也被用于定量其他的易位融合基因水平。

细胞因子的表达分析：许多不同类型的细胞都能分泌低分子量的蛋白质，其中包括淋巴细胞、抗原递呈细胞、单核细胞、内皮细胞和成纤维细胞。细胞因子可被分为不同的组：白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、转化生长因子和化学因子。为了阐明在许多炎症反应，自身免疫性疾病和器官移植排异中的免疫致病途径，细胞因子mRNA表达谱的可靠定量是很重要的。尽管被检样本中细胞因子含量往往极低，然而实时荧光反转录PCR以其高敏感性和准确性在细胞因子的定量中越来越受到青睐。使用双色荧光标记探针，结合不同的引物设计，可以实现对某些先天性疾病的定量检测。应用实时荧光定量PCR方法对β地中海贫血症(β地贫)患者与γ珠蛋白mRNA水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解β地贫的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。迄今对遗传性物质改变引起的疾病还无性根治，只能通过产前监测和产前基因诊断，减少病婴出生。因此，实时荧光定量PCR方法可用于产前监测和产前基因诊断。

病毒感染的定量监测：扩增技术的发展使得对病毒的定性或定量检测的能力随之提高，也使研究病毒的负荷和疾病进展的关系成为可能。目前运用较多的是在器官移植中对使用免疫抑制剂的患者用实时荧光定量PCR来定量测定巨细胞病毒感染。研究表明在骨髓移植的患者中用实时荧光定量PCR检测巨细胞病毒感染比传统的pp65抗原试验更敏感，抗巨细胞病毒药物治疗能使血中的病毒含量下降。目前，用此方法还进行了对结核分枝杆菌、免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、巨细胞病毒、EB病毒、淋球菌、沙眼衣原体，人乳头瘤病毒等病原体可以进行准确的定量检测。同样，在国内，2004年针对SARS流行性病的检测和诊断使得荧光定量PCR技术得以应用和发展。荧光定量PCR问世后的几年中，积累了大量有关病原体核酸量与感染性疾病发生、发展和预后之间关系的资料，这些研究资料不断丰富，将形成感染性疾病的临床分子诊断标准。目前，实时荧光PCR技术已应用于肝病、性病以及人类免疫缺陷病毒(HIV)等各种病原体的临床诊断，为实现快速；准确诊断提供了有效的检测方法。