基因表达系统研究进展

发布时间: 2022-03-04 08:32:13 浏览：次

摘要随着世界分子生物学的研究不断发展，基因表达技术有了很大的提高。到目前为止，人们已经研究出多种原核和真核表达系统用以生产重组蛋白。原核生物表达系统主要有大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统等；真核生物表达系统主要包括酵母表达系统、丝状真菌表达系统等。各种表达系统各具优缺点，对其进行了详细介绍。

关键词基因表达；原核表达系统；真核表达系统

中图分类号Q786文献标识码A文章编号1007-5739（2008）02-0205-03

随着世界分子生物学研究不断深入，基因表达技术有了很大的提高。迄今为止，人们已经研究开发出多种原核和真核表达系统用以生产重组蛋白。例如，原核生物表达体系中的大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统等，其中大肠杆菌表达系统被广泛应用，真核生物表达系统比较复杂一些，包括酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。

高荣凯等（1997）认为，现有外源基因表达系统主要包括：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫杆状病毒、动物乳腺生物反应器及植物表达系统等。这些外源基因表达系统在基因表达量、表达产物的分离纯化及活性、成本等方面各有优缺点。

克隆基因的表达对研究其所编码蛋白质的结构与功能及其实际应用都是十分重要的。克隆基因可以放在不同的宿主细胞中表达，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母、昆虫细胞、培养的哺乳类动物细胞，以至整体动、植物。能否使目的基因在不同的系统中成功表达，取决于我们对这些系统中基因表达调控机理的认识程度。

1原核生物表达系统

在各种表达系统中，最早采用的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术主要是将已克隆目的基因片段的载体转化细菌（一般是大肠杆菌），通过诱导表达、纯化获得所需的目的蛋白。

由于细菌培养操作简单、生长繁殖快、价格低廉，外源基因表达产物的水平高（如大肠杆菌中目的蛋白的表达量可超过细菌总蛋白量的80%），基因背景和表达特性清楚等因素，使得细菌表达系统成为最受欢迎的异源蛋白表达系统之一。此表达系统中最为常用的是大肠杆菌和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

1.1大肠杆菌表达系统

自20世纪70年代以来，大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。尽管基因工程表达系统已经从大肠杆菌扩大到酵母、昆虫、植物及哺乳动物细胞，并且近年来出现了很多新型的真核表达系统，但是大肠杆菌仍然是基因表达的重要工具。尤其是进入后基因组时代以来，有关蛋白结构以及功能研究的开展，对基因表达的要求更高，这时大肠杆菌往往是表达的第一选择。

大肠杆菌具有培养条件简单、生长繁殖快、安全性好、可以高效表达不同外源基因产物等特点，是许多外源基因表达系统中最好的一种，是目前研究最深入、发展也最完善的表达系统，大量的有价值的多肽和蛋白质已在大肠杆菌中获得了超量表达，如花生条纹病毒外壳蛋白基因、木聚糖酶基因、大蒜病毒外壳蛋白基因等都已在大肠杆菌中获得了表达。但不容忽视的是大肠杆菌也并不是万能的宿主，有些蛋白质必须经过翻译后修饰（如糖基化、特定位点的切割）才能具有完全的生物活性，表达这些蛋白质时最好选择真核细胞作为宿主。

大肠杆菌表达体系与其他表达体系相比，具有一些缺点：①高效表达易形成包涵体。②不能进行翻译后的加工修饰，如糖基化、磷酸化及酰基化等。外源基因在大肠杆菌中的表达是一个复杂的过程。影响表达效率的因素很多，仅改进1个或2个方面是不能取得明显效果的，必须结合外源蛋白的具体性质及表达载体、宿主菌的特点，选择出合适的表达条件。

基因表达过程是一个复杂的过程，涉及基因的转录、翻译、翻译后加工、细胞的代谢以及细胞内基因与蛋白、蛋白与蛋白之间的相互作用。进入后基因时代之后，大肠杆菌首先被选作研究蛋白组学、基因功能、蛋白质网络等新课题的模型，揭示了很多基因表达的未知领域，同时提供了更多发展大肠杆菌表达系统的依据。伴随分子生物学新技术的涌现，大肠杆菌势必在实验研究及工业生产重组蛋白的应用中发挥出更大的作用。随着对大肠杆菌表达系统研究的不断深入，随着更多的表达机理和影响因素的发现，将会有更好的大肠杆菌表达系统被人类加以利用。

1.2枯草芽孢杆菌表达系统

枯草芽孢杆菌是一类好氧型、内生抗逆孢子的杆状细菌，广泛存在于土壤、湖泊、海洋、动植物的体表，自身没有致病性，只具有单层细胞外膜，能直接将许多蛋白分泌到培养基中。在营养缺乏的条件下，枯草芽孢杆菌停止生长，但同时加快代谢作用，产生多种大分子的水解酶和抗生素，并诱导自身的能动性和趋化性，从而恢复生长。在极端的条件下，还可以诱导产生抗逆性很强的内源孢子。作为革兰氏阳性细菌的典型代表，对于其生理、生化、遗传及分子生物学的研究已有40多年的历史。近年来，随着分子生物学和基因工程的发展，枯草芽孢杆菌作为基因工程表达系统发展迅速，并展现出良好的应用前景。

枯草芽孢杆菌有一个得到很好开发的分泌系统，重组蛋白质常常能以可溶的活性形式高产量地分泌到培养基中。但由于枯草芽孢杆菌同时也分泌一些蛋白酶，它们有很强的降解活性，因此这一点也就必然不会极其具有吸引力。另外，可用的载体相当有限，极少有蛋白质在枯草芽孢杆菌中的表达高于在大肠杆菌中的表达。

1.3链霉菌表达系统

链霉菌属革兰氏阳性细菌，具有单层细胞外膜，因而分泌的蛋白质常常能直接分泌到培养基中。在过去的10多年中，对链霉菌表达并分泌出具有生物活性的真核基因产物的能力进行了广泛深入的研究，每年都有不少有关真核基因及一些非链霉菌来源的原核基因在链霉菌中表达的报道。牛生长素基因、人干扰素α1基因、α2基因、人乙肝表面抗原（HBSAg）基因、人白细胞介质素基因、人肿瘤坏死因子（TNF）基因、鼠肿瘤坏死因子基因、人体T细胞受体CD4基因、胰岛素原基因等成功地在链霉菌中得到了表达。链霉素成为继大肠杆菌、枯草芽孢杆菌之后又一个有价值的基因表达的宿主。

链霉菌作为基因工程受体菌的优点和缺点：

杨闰英等（1996）研究报道，链霉菌作为某些基因表达的受体菌有其自身的优越性：首先，利用链霉菌进行工业化规模生产抗生素的历史悠久，在工业规模发酵技术方面已积累了相当丰富的经验，因而可利用现有的技术及设备生产链霉菌表达的外源基因产物；其次，链霉菌产生丰富的胞外酶，这些酶常常直接分泌到培养基中，因而研究这些胞外酶分泌系统并应用于相应的基因工程技术中，使外源基因分泌性表达，从而可以简化链霉菌产生的外源基因产物的分离和纯化；同时，链霉菌的生长伴随着形态分化过程，它一直受到科学家的注意和广泛的研究。对链霉菌的分子遗传学研究的长足进展，特别是有关链霉菌质粒的分子生物学、链霉菌启动子、链霉菌蛋白质分泌的信号序列等方面研究的综合进展，给外源基因在链霉菌中的表达提供了理论基础。在链霉菌中表达的蛋白质常常是可溶性的，因此就无需为了获得具有生物活性的蛋白质而使表达的蛋白重新溶解并折叠成正确的构型；最后，链霉菌作为基因表达的受体，其致病性小。

虽然链霉菌的克隆体系已建立得较为完善，然而在链霉菌中直接引入外源基因的操作如转化等要比操作大肠杆菌复杂。大多数链霉菌由于可能存在着这样和那样的限制-修饰系统，一般难以转化或转化频率低。另外，能与大肠杆菌操作中相比拟的用于基因表达的启动子和载体，特别是诱导型的超量表达载体的发展还只是刚刚起步。

从上可以看出，原核表达系统有很多优点，但也有不足，它的主要缺点有：①没有真核转录后加工的功能，不能进行mRNA的剪接，所以只能表达cDNA而不能表达真核的基因组基因；②没有真核翻译后加工的功能，表达产生的蛋白质，不能进行糖基化、磷酸化等修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构象折叠，因而产生的蛋白质常没有足够的生物学活性；③表达的蛋白质经常是不溶的，会在细菌内聚集成包含体（inclusion body），尤其当表达的目的蛋白量超过菌体总蛋白量的10 %时，就很容易形成包涵体。

2真核生物表达系统

真核生物表达系统易于表达来自高等生物的外源基因，常用的真核生物表达系统主要包括真菌、酵母、昆虫、动物和哺乳类细胞等。

2.1酵母表达系统

一般而言，用原核细胞作宿主表达真核基因操作简单，成本低，但有时会因为所表达的外源基因的产物不能正确折叠或缺少翻译后的修饰导致产物没有生物活性，而且原核细胞中的有毒蛋白或有抗原作用的蛋白可能会混杂在终产物中。采用哺乳类细胞作宿主可以解决以上问题，但操作困难，产率低，且有时会导致病毒感染。酵母作为单细胞低等真核生物，具有易培养、繁殖快、便于基因操作等优点，渐渐地被开发作为外源基因表达系统。

酵母菌是一类低等真核生物，它既有类似原核生物的生长特性，又有一般真核生物的分子和细胞生物学特性。它是很大的一个群体，据最近报道，至少包括80个属700个种10 000多个独立菌种。

酵母系统表达外源基因的优点在于：①酵母长期广泛应用于酿酒和食品工业，不会产生毒素，安全性可靠；②酵母是真核生物，能进行一些表达产物的加工，有利于保持生物产品的活性和稳定性；③外源基因在酵母中能分泌表达，表达产物分泌至胞外不仅有利于纯化，而且避免了产物在胞内大量蓄积对细胞的不利影响；④遗传背景清楚，容易进行遗传操作；⑤较为完善的表达控制系统，如PMA1和PDR5等强启动子可以介导目的蛋白高水平表达，表达蛋白的丰度可以达到膜蛋白的10％；此外，采用诱导表达启动子可以在时间上严格控制目的蛋白的表达，如GAL1-10（半乳糖诱导）、PH05（胞外无机磷诱导）和HSE（37℃温度诱导）；⑥生长繁殖迅速，培养周期短，工艺简单，生产成本低。酵母菌用于真核基因的表达、分析，既具有原核表达系统生长迅速、操作简单、价格便宜等优点，又具有类似哺乳动物细胞的翻译后修饰过程，因而特别适用于大量生产真核重组蛋白，正是由于有这些优点，使酵母功能基因组的研究得以走在生物功能基因组研究的前列，是应用最为普遍的真核表达系统之一。

酵母表达系统是最近发展起来的新型表达系统，最先使用的是酿酒酵母，1981年Hitzeman等用酿酒酵母成功地表达了人干扰素；但是，以酿酒酵母为主体的表达系统也存在一些明显的局限性，如缺乏强有力的启动子、分泌效率差、质粒不稳定、难以达到很高发酵密度、只能分泌少量蛋白、其翻译后加工与高等真核生物有所不同等，这对外源基因的表达是很大的障碍。因此，人们在此基础上又寻找到新的酵母表达系统——毕赤酵母，即甲醇营养型表达系统。

2.2丝状真菌

由于酵母是比较低等的真核生物，它对分泌蛋白的修饰度一般很高，而且修饰模式也与高等真核生物有很大差别。因此，在酵母中异源蛋白的表达相对是比较低的。丝状真菌可以弥补细菌和酵母的不足之处。一是丝状真菌可以大量分泌各种酶蛋白，如Trichoderma reesei生产纤维素酶，产率达40g/L。另外，丝状真菌的蛋白质糖基化模式与高等真核生物的模式非常相似，而且丝状真菌的发酵工艺及下游加工技术也发展的比较完善。二是丝状真菌的新型的生物合成能力及有效地分泌机制，能使人们得到大量胞外生物活性蛋白，通过增加拷贝数及活性改造方法，扩大传统突变和选择方法，提高了工业生产菌株生产能力。大多数此类表达系统主要用于生产丝状真菌本身的内源性蛋白，如用作工业或食用的酶类。但由于其转化效率较低，基因背景了解不充分，以及细胞外大量分泌蛋白酶的存在，使得异源蛋白的表达较为困难。

2.3昆虫表达系统

昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统。主要利昆虫细胞、昆虫整体和杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。它具有真核表达系统的翻译后加工功能，如二硫键的形成、糖基化及磷酸化等，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白；其最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%；可表达非常大的外源性基因（-200kD）；具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个外源基因的能力；对脊椎动物安全。由于病毒多角体蛋白在病毒总蛋白中的含量非常高，至今已有很多外源基因在此蛋白的强大启动子作用下获得高效表达。

邓宁（1996）报道，杆状病毒是最大的环状DNA病毒，其基因组在90～230kb之间，具有编码上百种蛋白质的能力。杆状病毒不仅是研究细胞分子生物学的重要工具，也是许多真核和原核基因在昆虫细胞中表达的中间载体。杆状病毒转染的昆虫细胞表达系统，表达重组蛋白量可高达5 000 mg/L；具有与哺乳动物系统相同的翻译后修饰过程，因而产生的重组蛋白与哺乳动物蛋白的抗原性、免疫性、功能基本一致；易于鉴定纯化重组病毒及重组蛋白产物，使该系统成为一个有效的真核表达系统。

2.4哺乳动物细胞表达系统

早期的哺乳动物细胞表达系统一般用来研究基因的功能与调控，所以很多载体都源自动物病毒，如 SV40、多瘤病毒、泡疹病毒和牛乳头状瘤病毒等。从总体上讲，这些载体不适于表达重组蛋白，因为它们的宿主范围有限，而且只是瞬时表达，产率低，克隆步骤繁琐，某些病毒的DNA片段还有潜在的致癌作用，不能用于表达供人使用的药物蛋白或其他蛋白。同时，有些人的医用蛋白只能在哺乳动物细胞中才能正确地修饰，因此研究人员致力于改进原有的载体和开发新的载体，以使哺乳动物细胞能够成为新的生物反应器。哺乳动物细胞表达的重组产物，可带有复杂的糖链结构，和人源糖蛋白的糖链结构较为相似，故成为目前主要的异源糖蛋白表达系统。与其他系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。从最开始以裸露DNA直接转染哺乳动物细胞至今的30余年间，哺乳动物细胞表达系统不仅已成为多种基因工程药物的生产平台，在新基因的发现、蛋白质的结构和功能研究中亦起了极为重要的作用。

2.5动物乳腺反应器

用转基因动物表达重组药用蛋白，是一个新兴的生物工程领域。目前，至少有2个产品，即转基因绵羊表达的人α1-抗胰蛋白酶和转基因山羊表达的抗凝血酶Ⅲ，已进入I期临床试验。通常，转基因动物能产生非常类似于哺乳动物细胞系的糖链结构，但是其糖链结构仍随种属和器官的不同而不同，从而影响了糖基化的效率和专一性。将外源糖基转移酶基因导入转基因动物中共表达时，其分泌的乳汁中除含有所要表达的外源糖蛋白外，还含有大量游离的糖链结构成分。

2.6植物表达系统

主要包括利用植物整体、病毒载体、油体表达外源蛋白。2个具有历史意义的重大发现促生了植物转基因技术，使得外源基因能够在转基因植物中稳定表达。一是发现单个植物细胞具有遗传全能性，即从单个细胞可以培育出与亲代性状完全相同的完整植株；二是发现通过植物病原菌的介导可以将外源基因转入植物基因组中，其中最常用的是根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）。根癌农杆菌带有低拷贝数的肿瘤诱导性质粒（Ｔi质粒），当该菌感染植物细胞之后，Ｔi质粒能够将其DNA的一部分（T—DNA）转入并整合到植物细胞基因组中，因为在T-DNA的两侧存在插入所必需的重复序列，只要将目的基因插入两侧翼序列之间，就可以将该基因导入植物细胞中，从而使转基因植株获得预期的性状。除转基因植物外，随着分子植物病毒学的发展，植物病毒也很快发展成为一种很有前景的表达载体，利用一些经基因工程改造的植物单股正链RNA病毒感染高等植物，可以快速扩增病毒相关RNA，从而在短期内产生大量的目的蛋白。

植物表达系统的优点是：转基因植物可以大面积种植，成本较低。例如在转基因烟草中生产植酸酶，其含量达到可溶性蛋白的14％。为了降低植物表达蛋白的提取、纯化成本，已研制出种子油体表达体系，目前已在植物油体中成功地表达了水蛭素、木聚糖酶、β-葡糖醛酸苷酶等蛋白。

3总结

总之，各种表达系统各有优缺点，因此在选择表达系统

时，应充分考虑各种因素，如要表达蛋白的性质、生产成本、表达水平、安全性、表达周期等。随着对外源基因表达系统研究的不断深入，随着更多表达机理和影响因素的发现，相信在不久的将来，原核与真核两种表达系统在重组蛋白的生产研究中仍然都会占有一席之地，并将出现更多更加完善的表达系统。

4参考文献

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