一种新的植物泛素结合酶体外泛素化检测方法

摘要：泛素结合酶是一类在泛素化修饰过程中起重要生物化学功能的蛋白。对于被预测为泛素结合酶的蛋白进行体外泛素化活性检测，是确定其泛素结合酶功能必不可少的试验步骤，试验结果可以为后续研究提供重要的线索。目前体外泛素化反应存在体外表达纯化蛋白工作量大、反应复杂、假阴性率高等问题。本研究针对以上问题进行了改良，开发出一种新的植物泛素结合酶活性体外检测方法，该方法无需裂解细胞提取、纯化蛋白，也不需要做体外反应，简便易行，结果更稳定可靠。应用该方法对花生泛素结合酶AhUBC34和盐芥泛素结合酶TsUBC33进行了检测，结果证明这两个蛋白都具有泛素结合酶活性。

关键词：泛素结合酶；体外泛素化检测；检测方法；花生；盐芥

中图分类号：S18：Q55文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）03-0120-05

Abstract The ubiquitin-conjugating enzymes play key biochemical roles in the ubiquitination modification. The in vitro ubiquitination assay is essential to the study of the predicted ubiquitin-conjugating enzyme， which supplies important clues for the following study. So far， the in vitro ubiquitin-conjugating enzyme activity analysis needs huge amount of works such as protein expression and purification. The process is complex， and the ratio of false negative is high. In this study， we developed a new system to detect the plant ubiquitin-conjugating enzyme activity which omits the protein purification and in vitro reaction steps in the old method. This new system is more convenient and stable. We applied this system to detect Arachis hypogaea UBC34 and Eutrema salsugineum （Thellungiella salsuginea） UBC33， and proved the ubiquitin-conjugating enzyme activity of these two proteins.

Keywords Ubiquitin-conjugating enzyme； In vitro ubiquitination assay； Assay method； Peanut； Eutrema salsugineum

泛素（ubiquitin，Ub）介導的26S蛋白酶体系统通过参与降解生长发育中不正常的蛋白为生物提供足够的氨基酸供应，并通过降解一些限速步骤的蛋白来精确调节生物的生理过程，为生物生长发育以及应对外界环境的变化提供便利，对生物维持正常的生理功能非常重要。泛素介导的26S蛋白酶体降解途径中主要参与分子包括泛素、泛素活化酶（Ub-activating enzyme）E1、泛素结合酶 （Ub-conjugating enzyme）E2、泛素连接酶 （Ub-protein ligase）E3、26S蛋白酶复合体（26S proteasome）以及去泛素化酶（deubiquitylating enzymes，DUBs）。泛素化过程是以上几种酶协同作用的结果。首先，泛素的C末端甘氨酸残基在ATP存在的情况下被E1激活，激活的泛素通过硫酯键结合到E1的一个半胱氨酸上；然后激活的泛素再被转移到E2蛋白的活性半胱氨酸残基上；随后在E3的作用下E2上的泛素共价结合到靶蛋白赖氨酸残基上；这个过程不断重复形成多泛素化蛋白。多泛素化的蛋白经过26S蛋白酶体进行降解，成为单个的氨基酸残基，同时去泛素化酶把多泛素链拆解成单个的泛素，重新进行利用[1]。其中泛素结合酶是一类在26S蛋白酶体降解途径中起重要生物化学功能的蛋白[2]。目前的研究表明，泛素结合酶是多泛素链组装的关键因子，控制了泛素链的起始和延伸，决定了底物泛素化修饰的类型和最终结果[3]。

对于预测为泛素结合酶的蛋白来说，对其进行体外泛素化活性检测，是确定其泛素结合酶功能必不可少的，试验结果可以为其后续的研究提供重要的线索。目前的泛素结合酶体外泛素化反应体系存在如下缺点：泛素结合酶体外泛素化检测所需的主要分子包括Ub、E1、E2蛋白都需要利用大肠杆菌进行体外表达，然后裂解细胞提取蛋白，有一些还需要进行纯化，纯化后的蛋白为了维持其活性需要保存在-80℃冰箱，过程复杂，工作量大。另外传统的体外泛素化反应检测需要配制反应缓冲液，将Ub、E1、E2等蛋白都加入反应缓冲液中，在一定温度和条件下进行反应。反应缓冲液中必须包含ATP以提供能量，ATP化学性质不稳定，反应缓冲液难以长时间保持活性；体系中加入各种蛋白的量以及反应时间和条件也不相同，都需要各自摸索条件，工作量巨大。如果检测不到泛素结合酶活性，无法区分是由于蛋白表达、纯化、保存、冻融和反应等步骤的问题，还是蛋白本身没有泛素结合酶的功能，容易造成假阴性[4，5]。本研究针对以上泛素结合酶体外泛素化反应体系存在的缺点进行了改进，研究出一种用于体外检测泛素结合酶活性的方法，并利用该方法对花生泛素结合酶AhUBC34和盐芥泛素结合酶TsUBC33进行检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

LB培养基（1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1% NaCl，去离子水配制，高压蒸汽灭菌）；IPTG；以上试剂均为进口或国产分析纯试剂。反转录试剂盒购自TaKaRa公司。表达蛋白所用大肠杆菌菌种BL21（DE3）和蛋白表达载体pGEX-6P-1由中国科学院遗传与发育生物学研究所谢旗研究员馈赠。载体pACYCDuet和pCDFDuet由华南师范大学阳成伟教授馈赠。Flag抗体（F725）购自Sigma-Aldrich公司。辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗（D110058）购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 体外泛素结合酶活性检测体系的建立

选择拟南芥AtUBA2作为E1[4]，构建蛋白表达载体pGEX-6P-1-AtUBA2；选择拟南芥AtUb[4]作为ubiquitin供体，构建蛋白表达载体pACYCDuet-AtUb。 将pGEX-6P-1-AtUBA2转入BL21（DE3）感受态细胞，挑取1个单克隆，命名为C1，保存菌种，用IPTG诱导表达蛋白，将C1诱导前和诱导后样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色，脱色后观察蛋白诱导表达情况。将上述成功诱导E1蛋白表达的菌种制备感受态细胞备用。

将pACYCDuet-AtUb转入C1感受态细胞，挑取1个单克隆，命名为C2，保存菌种，用IPTG诱导表达蛋白，将C2诱导前和诱导后样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色，脱色后观察蛋白诱导表达情况。将上述成功诱导E1蛋白和Ub蛋白表达的菌种制备感受态细胞备用。

C1和C2株系感受态细胞即是泛素结合酶活性检测体系的主要组分。下一步只需将待检测E2构建到与pGEX-6P-1和pACYCDuet复制起点不一样的蛋白表达载体质粒上，分别转化C1和C2感受态细胞，分别诱导蛋白表达，通过蛋白印迹方法检测待测E2蛋白是否有符合E2+Ub分子量迁移的条带即可。

1.3 基因扩增及原核表达载体构建

利用拟南芥AtUBC10上游引物5′CGGAATTCGATGGCGTCGAAGCGGATCTTG3′和下游引物5′ACGCGTCGACTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGCCCATGGCATACTTCTGAG3′将AtUBC10蛋白C端加上Flag标签并构建到pCDFDuet载体上。

花生AhUBC34 氨基酸序列为：MAEKSCIKR

LQKEYRALCKEPVSHVVARPSPNDILEWHYVLEG

SEGTPFAGGYYYGKIKFPPEYPYKPPGISMTTPNG

RFMTQKKICLSMSDFHPESWNPMWSVSSILTGLLS

FMMDNSPTTGSVNTTTAEKQRLAKSSLSFNCKNAT

FRKMFPEYVEKYNQEQQLSEQVPPEQASSEAAPN

DTSPKVLLEKNLDSTEEGTKRVEQLKVVKKNGKQ

PFPAWMMLLLFSIFGVVMALPLLQL。據预测AhUBC34是一个跨膜蛋白，为增加蛋白的可溶性，我们利用AhUBC34上游引物5′CGGAATTCGATGGCAGAAAAGTCATGTATCAAG3′和下游引物5′ACGCGTCGACTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTTGCTTTCCGTTTTTCTTTACAACC3′扩增出去掉跨膜域并在C端加上Flag标签的AhUBC34，之后用EcoRⅠ和SalⅠ将改造后的AhUBC34构建到pCDFDuet载体上。

盐芥TsUBC33的氨基酸序列为：MAEKACIKRLQKEYRSLCKEPVSHVVARPSPNDILEWHYVLEGSDGTPFAGGFYYGKIKFPAEYPYKPPGITMTTPNGRFATQKKLCLSMSDFHPESWNPMWSVSSILTGLLSFMMDNSPTTGSVNTTVAEKQLLAKSSLAFNC

KNATFRKLFPEYLEKYSQQQVAEKEEEATATQQR

TPEDSPEKDNARDESEKSVGLRKEDTKEVGLNKR

RRNKKEALPGWIIVLLVSIVGVVMALPLLQL。对盐芥TsUBC33用同样的方法扩增出去掉跨膜域并在C端加上Flag标签的TsUBC33， 用EcoRⅠ和SacⅠ将改造后的TsUBC33构建到pCDFDuet载体上，所用引物分别为5′-CGCGGATCCGATGGCAGAGAAAGCTTGTATAAAGC-3′和5′-CGAGCTCTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTTCTTT

CTTGTTCCTTCTCCTC-3′。

1.4 IPTG诱导表达蛋白检测

将相应质粒转化BL21（DE3），挑取平板上的阳性菌落1～2个，接种于加入了合适抗生素的5 mL LB液体培养基中，37℃、200 r/min培养过夜；将培养好的菌液接种于50 mL加入了合适抗生素的液体培养基中（用150 mL锥形瓶），调OD600至0.1左右（一般需加1 mL左右菌液），37℃培养约80 min至OD600为0.4～0.6之间时，吸取1 mL菌液，12 000 r/min离心1 min，弃上清，液氮速冻，保存于-80℃超低温冰箱，作为诱导前蛋白样品，其余菌液中加入0.1 mol/L的IPTG至终浓度为50 mmol/L，25℃培养12～16 h；吸取适量菌液，以保证样品中的细菌数目大致相近，12 000 r/min离心1 min，弃上清，液氮速冻，保存于-80℃超低温冰箱，为诱导后蛋白样品；取诱导前和诱导后的样品，分别加70 μL 1×PBS，混匀，沸水浴4 min，上样20 μL，SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后考马斯亮蓝染色，脱色观察结果；考马斯亮蓝染色确定E1、Ub和目的片段等均有表达后，将诱导后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，每个点样孔上样15 μL，准备进行蛋白印迹杂交（Western Blot）。

1.5 SDS-PAGE 电泳条件

配置 12%的分离胶和5%浓缩胶，蛋白样品与上样缓冲液混合后沸水浴 3～5 min，冷却后即可进行电泳；电泳条件：稳压100 V；15～30 mA/板，1～2 h；电泳结束后将胶小心取下，放入考马斯亮蓝 R250 摇动染色2 h左右，然后考马斯亮蓝脱色液脱色，当胶的背景脱色干净后见清晰蛋白条带时拍照。

1.6 蛋白质印迹（Western Blot）步骤

SDS-PAGE电泳结束后从玻璃板中取出凝胶，去掉浓缩胶，保留分离胶，将其浸泡在转膜缓冲液中，剪取与凝胶同樣大小的硝酸纤维素膜，并浸泡于膜转移缓冲液中。在凝胶转印夹的黑色孔板上放上纤维衬垫和滤纸，用玻璃棒赶走气泡，之后放上胶，然后将硝酸纤维素膜盖在胶上，轻轻滚动玻璃棒赶走气泡，然后依次放上滤纸及纤维衬垫。稳压转膜100 V，70 min，保持低温。膜封闭：室温下封闭缓冲液中30 min，倒掉封闭缓冲液，加入杂交膜清洗液（TBST buffer），室温下5 min，重复TBST Buffer一次；倒掉TBST Buffer，加入anti-Flag一抗，室温下孵育1 h；加入TBST Buffer，室温下5 min，重复一次，加入二抗，室温下孵育1 h；洗膜：TBST buffer室温洗膜2次，每次5 min；从ECL显色发光试剂盒中各取1 mL Stock A和Stock B混合，均匀浸润膜；用保鲜膜封好后于Bio-Rad照胶仪器显影。

2 结果与分析

2.1 体外泛素结合酶活性检测体系的建立

C1诱导前和诱导后蛋白表达情况见图1，可以在预期位置看到明显的AtUBA2诱导表达条带。

C2诱导前和诱导后蛋白表达情况见图2，可以在预期位置分别看到明显的AtUBA2和AtUb的诱导表达条带。

拟南芥泛素结合酶AtUBC10是体外泛素化检测常用的泛素结合酶，我们以AtUBC10为例，通过上述系统对AtUBC10的泛素结合酶活性进行检测，如图3所示，观察诱导前后蛋白条带变化，在预期分子量的位置，AtUBA2、AtUb和AtUBC10蛋白均被诱导表达。泛素结合酶活性结

果如图4所示，除检测到AtUBC10蛋白条带外，还能够成功检测到另一条迁移带，分子量符合AtUBC10加上一个Ub分子的大小，说明该检测体系构建成功。

2.2 花生AhUBC34泛素结合酶活性检测

利用以上系统，我们检测了花生AhUBC34的泛素结合酶活性。花生AhUBC34基因序列来源于栽培品种鲁花14的转录组测序结果。构建pCDFDuet-AhUBC34蛋白表达载体，将其转入BL21（DE3）细胞，挑选单克隆进行培养，诱导蛋白表达，并将诱导前后的样品进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色，证明AhUBC34蛋白能够成功被诱导表达。随后将pCDFDuet-AhUBC34分别转入C1和C2感受态细胞，挑选单克隆进行培养，诱导蛋白表达，并将诱导前后的样品进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色，证明AtUBA2、AtUb和AhUBC34蛋白均能够被成功诱导表达，结果见图5。将上述诱导前后的样品进行SDS-PAGE电泳，随后进行蛋白印迹，除检测到AhUBC34蛋白条带外，还能够成功检测到另一条迁移带，分子量符合AhUBC34加上一个Ub分子的大小，结果见图6，证明AhUBC34具备泛素结合酶活性。

2.3 盐芥TsUBC33泛素结合酶活性检测

为了进一步验证以上泛素结合酶活性检测方法是否可行，我们检测了盐芥泛素结合酶TsUBC33的活性。盐芥TsUBC33来源于山东型盐芥（NCBI reference sequence： XM_006402032.1）。构建pCDFDuet-TsUBC33蛋白表达载体，将其转入BL21（DE3）细胞，挑选单克隆进行培养，诱导蛋白表达，并将诱导前后的样品进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色，证明TsUBC33蛋白能够成功被诱导表达。将pCDFDuet-TsUBC33分别转入C1和C2感受态细胞，挑选单克隆进行培养，诱导蛋白表达，并将诱导前后的样品进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色，证明AtUBA2、AtUb和TsUBC33蛋白均能够被成功诱导表达，结果见图7。将上述诱导前后的样品进行SDS-PAGE电泳，随后进行蛋白印迹，除检测到TsUBC33蛋白条带外，还能够成功检测到另一条迁移带，分子量符合TsUBC33加上一个Ub分子的大小，结果见图8，证明TsUBC33具备泛素结合酶活性。

3 结论

相比现有的检测方法，应用本系统进行泛素结合酶活性检测，可以省去裂解细胞、提取蛋白的繁琐步骤，减少在提取和保存蛋白以及蛋白冻融时造成的活性损失，减少假阴性；可以省去繁复的活性检测步骤，无需建立体外反应体系，无需摸索反应条件；本系统提供的蛋白表达株系可以稳定遗传和表达，用此方法建立C1和C2后，可针对不同的E2进行多次反应，无需多次表达蛋白；本系统适用于多种植物泛素结合酶活性的检测，对于其它物种的泛素结合酶活性检测同样适用，只需根据物种调整E1的种类即可。本系统的应用将有力地推进泛素结合酶功能的研究。

参 考 文 献：

[1] Vierstra R D. The ubiquitin/26S proteasome pathway， the complex last chapter in the life of many plant proteins[J]. Trends in Plant Science， 2003， 8（3）：135-142.

[2] Bachmair A， Novatchkova M， Potuschak T， et al. Ubiquitylation in plants： a post-genomic look at a post-translational modification[J]. Trends in Plant Science， 2001， 6（10）：463-470.

[3] Ye Y， Rape M. Building ubiquitin chains： E2 enzymes at work[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2009， 10（11）：755-764.

[4] Zhao Q， Tian M， Li Q， et al. A plant-specific in vitro ubiqutination analysis system[J]. The Plant Journal， 2013， 74（3）：524-533.

[5] Kraft E， Stone S L， Ma L， et al. Genome analysis and functional characterization of the E2 and RING-type E3 ligase ubiquitination enzymes of Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2005， 139（4）：1597-1611.