TYK2基因与家兔肠炎的易感性研究

材料与方法

1.1 试验兔群的构建及样本采取

选取四川农业大学教学试验兔场饲养的新西兰兔为试验材料，随机选择35日龄健康无病、三代内无亲缘关系的480只新西兰兔为试验动物，构建病例组-对照组肠炎易感性试验兔群。选取三代内无亲缘关系、胎次相近、健康无病、体重相当的35日龄新西兰断奶仔兔60只，作为低纤维日粮肠炎试验兔群，饲喂低纤维饲料（CF=8.96%）。上述2个群体构建的具体方法、分组情况及组织样品采取参考Zhang等[10]的方法。

1.2 DNA和RNA的提取及检测

试验采用DNA提取试剂盒AxyPrepTM Muitisource Genomic DNA Miniprep Kit（Axygen Biosciencs，USA），按照试剂盒说明书要求，从家兔耳组织中提取全基因组DNA。试验采用Trizol法（Invitrogen），严格按照其说明提取回肠和结肠组织总RNA。DNA和RNA的检测方法相同，先进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，后用核酸蛋白仪进行OD260/OD280值测定。

1.3 PCR扩增及产物测序

根据NCBI提供的家兔TYK2基因参考序列（XM_017338771.1），设计3对引物（表1）进行编码区的扩增。采用10 μL的反应体系：2×Taq PCR Mix（5 μL）、Forward primer/Reverse primer（各0.3 μL）、Template cDNA（0.8 μL）和ddH2O（3.6 μL）。将上述溶液混合后，按以下条件进行PCR反应：94 ℃变性3 min，94 ℃变性30 s、退火（具体的退火温度由梯度PCR结果决定）30 s、72 ℃延伸60～90 s，扩增35～38个循环，72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存。将PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收纯化后得到的PCR产物送至北京六合华大基因测序中心测序。

1.4 实时荧光定量PCR

先使用反转录试剂盒PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser（Cat.# RR047Q，TaKaRa），进行cDNA的合成，具体操作按试剂盒的说明书进行。然后采用2-△△CT法，以HPRT和GAPDH基因作为双内参，在CFX96TM Real-time System上检測TYK2基因在回肠和结肠组织中的mRNA表达水平。根据TYK2基因参考序列，设计荧光定量引物（表1），由北京六合华大基因有限公司合成。按照SYBR Premix Ex TaqTM II（TaKaRa，Dalian）试剂盒的使用说明书加样，使用标准品作为板间对照，并设NTC，每个待测样3个重复。

1.5 数据处理

基因分型的个体数直接以n表示，mRNA相对表达量表示为平均值±标准误。使用SAS 9.2软件分析TYK2基因与肠炎的遗传效应。运用SPSS 19.0分析处理，组间的差异比较采用单因素方差分析。P<0.05表示其差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 低纤维日粮诱导家兔肠炎炎症程度的分类

在60只低纤维日粮诱导家兔肠炎中（试验期间死亡和试验结束后屠宰），临床症状评分（CSS）为2和3分的有40只，其中35只的剖检症状分析评分（GLS）同样较高，主要表现为食欲下降、腹部胀气、盲肠内容物结块，大部分个体回肠内有胶冻状物质（22/35），部分个体结肠伴随着回肠出现胶冻状物质（17/35）。观察组织病理切片发现各肠断在发生严重肠炎时，都存在组织损伤和炎性损伤，并且回肠和结肠段病变得更为严重（图1）。患病家兔的回肠和结肠段，肠腔中未见红细胞和淋巴细胞内容物；肠绒毛多处毛细血管充血；部分肠上皮细胞坏死、溶解，可见少量中性粒细胞浸润（图1b和d中①标注）；肠绒毛中肠腺细胞发生坏死性溶解，可见嗜碱性粒细胞浸润（图1b和d中②标注）；黏膜固有层、黏膜下层结缔组织间的间质有炎性细胞浸润（图1d中③标注）。最终，将低纤维诱导试验兔群分为健康组（12只）、轻微肠炎组（13只）和严重肠炎组（35只）。

2.2 TYK2基因编码区扩增和直接测序结果

对新西兰兔TYK2基因的外显子区域，分别设计引物进行PCR扩增，扩增产物特异性好，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，电泳条带单一，明亮致密，大小与目的条带一致。将目的基因PCR扩增产物胶回收后，送至北京六合华大基因公司进行直接测序，共发现5个cSNP，分别为c.1095（exon7，G>A），c.1477（exon9，C>T），c.2013（exon13，C>T），c.2133（exon14，T>C），c.2166（exon14，C>T），其中c.1477位点发生非同义突变，导致氨基酸p.Leu 404 Phe（L>F）的改变，其余的cSNP均为同义突变。

2.3 c.1477与家兔肠炎易感性分析

试验共选取了480只新西兰兔（病例组253，对照组227），对c.1477位点采用直接测序的方法进行基因分型，结果发现纯合CC型、TT型、杂合CT型在病例组和对照组中个体数分别为156/118，20/58，77/51。

群体遗传结构分析发现在病例组和对照组中，C等位基因均处于优势地位，其频率分别为76.88%和63.22%（P<0.05），而T等位基因分别为23.12%和36.78%（P<0.05）。2群体中基因型频率CC（61.66% vs.51.98%），TT（7.91% vs.25.55%），CT（30.43% vs.22.47%）差异均显著（P<0.05）。通过SAS 9.2软件计算等位基因C增加了肠炎的易感性（OR：1.36；95% CI 1.269～2.151；P=0.019），而等位基因T对肠炎的发生起到了一定的保护作用（OR：0.81，95% CI 0.352～0.960；P=0.018）。HWE评估检验发现病例组和对照组都遵循HWE平衡定律（P>0.05）。使用SNPStasts软件评估5种遗传模型对该突变的可靠性。根据AIC和BIC值的大小，确定隐性模型为这个位点的最适模型。利用这个模型，关联性分析表明C/C基因型增加了肠炎的易感性（OR：1.73；95% CI 1.870～2.800；P<0.001）（表2）。

2.4 TYK2基因不同基因型和不同腸炎程度的mRNA水平呈现差异表达

通过荧光定量PCR分析TYK2基因，在不同基因型和不同肠炎程度组的回肠和结肠组织的mRNA相对表达水平，结果见图2。伴随着家兔肠炎炎症程度的加剧，TYK2基因的相对表达量在回肠和结肠中均相应增加，在严重组表达量最高，分别为0.531 2±0.048 1和0.483 5±0.051 2。TYK2基因在严重组回肠和结肠中的表达量均极显著高于健康组和轻微炎症组（P<0.01）。TYK2基因CC基因型在回肠和结肠中的表达量均最高，TT基因型的表达量最低，CT基因型的表达量居中。CC基因型的表达量与CT和TT基因型表达量的差异均达到显著水平（P<0.05）。由病例组-对照组肠炎易感性分析可知，TYK2等位基因C增加了肠炎的易感性，等位基因T对肠炎具有保护作用。结合上述mRNA表达量分析，CC基因型为肠炎易感基因型，TT基因型为保护基因型，对肠炎的发生具有一定遗传抗性。

3 讨论与结论

家兔肠炎是养兔业中最常见且死亡率最高的消化道代谢疾病。大量研究表明家兔肠炎的发生是多种因素共同作用的结果。致病病原微生物主要有大肠杆菌、病毒、寄生虫、真菌及其毒素等，其中以大肠杆菌导致的细菌性肠炎最常见[11]。非病源微生物导致的家兔腹泻，主要包括日粮粗纤维不足性腹泻，外界应激性腹泻，滥用抗生素相关性腹泻，盲肠炎腹泻等，其中日粮纤维性腹泻较为严重[12-13]。家兔日粮中的纤维可以维持肠道微生态平衡，促进消化系统的发育，增强胃肠蠕动，防止家兔异食癖等功能。该研究也发现60只低纤维诱导肠炎兔群表现为健康的只有12只、轻微肠炎和严重肠炎的分别为13只和35只。相关研究发现低纤维水平日粮（CF<12%，ADF<15%）可引起家兔发生非特异性肠炎从而导致腹泻[14]，这与该研究结论是一致的。

SNP（single nucleotide polymorphism）是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性，具有很高的遗传稳定性，是基因组中最简单、最常见的多态性形式，也是第三代分子生物学标记的代表[15]。基因编码区的SNP通常被人们称为cSNP（coding SNP），许多遗传性疾病是由非同义突变导致的，因而成为近年来研究的热点。该试验利用PCR产物纯化后直接测序法，发现TYK2基因（c.1477，C>T）等位基因C增加了肠炎的易感性，CC基因型为肠炎易感基因型，TT基因型为保护基因型，对肠炎的发生具有一定遗传抗性。近年来，相关研究发现家兔对低纤维日粮诱发的肠炎存在遗传抗性差异，也筛选出了一些抗性基因如TLR4，NOD2等[16]。同时，有研究指出TYK2基因广泛参与机体细胞炎症响应，介导机体免疫调控等一系列生命活动过程[5-6]。该研究发现TYK2（c.1477，C>T）是家兔肠炎风险等位基因，与家兔肠炎易感性显著相关，为家兔的抗病育种提供了一个可靠的辅助选择标记。

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