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子痫前期孕妇外周血CTGF基因启动子甲基化检测

发布时间: 2022-04-14 08:10:34 浏览:

报告如下。

1对象与方法

1.1研究对象

2017年7月—2018年2月,于青岛大学附属医院、聊城市人民医院、滨州市人民医院、临沂市人民医院产科,收集90例子痫前期病人(子痫前期组)和94例正常妊娠孕妇(正常对照组)的外周血样本。子痫前期的诊断标准参见乐杰主编的第6版《妇产科学》。正常妊娠孕妇纳入标准:本次妊娠正常,胎儿发育正常,未出现任何并发症,既往无不良孕产史,无糖尿病、肾脏疾病、免疫性疾病、癌症等病史。本研究获青岛大学附属医院伦理委员会批准,所有研究对象均签署知情同意书。子痫前期组病人收缩压及舒张压显著高于正常对照组(t=30.16、26.04,P<0.01),分娩孕周及胎儿出生体质量显著低于正常对照组(t=12.42、17.70,P<0.01);两组孕妇年龄差异无显著性(P>0.05)。见表1。

1.2研究方法

1.2.1样本采集于分娩前采集孕母外周血约2 mL,置于乙二胺四乙酸抗凝管中混匀,-80 ℃冰箱冻存,以备DNA的提取。

1.2.2DNA提取从-80 ℃冰箱中取出收集的样本,取400 μL孕妇外周血,使用血液基因组DNA提取试剂盒(TIANamp,Beijing,China),根据试剂盒操作手册进行DNA的提取,然后置-20 ℃冰箱保存。

1.2.3重亚硫酸盐转化MSP的模板是经重亚硫酸盐处理的DNA。利用DNA重亚硫酸盐转化试剂盒(TIANamp,Beijing,China)对上述提取的DNA进行转化修饰,使未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化的不变。然后对转化后的产物进行纯化。

1.2.4MSP由Invitrogen生物公司设计合成两对引物:一对结合处理后的甲基化DNA,另一对结合处理后的未甲基化DNA。引物序列见表2。按照MSP试剂盒(TIANamp,Beijing,China)配制20 μL反应体系:DNA模板500 ng,上下游引物各1 μL,Taq酶0.4 μL,dNTP 1.6 μL,Buffer 2 μL,用蒸餾水补足20 μL。反应条件:95  ℃预变性5 min;95  ℃变性30 s,52  ℃复性30 s,72 ℃延伸20 s,35个循环;72 ℃中止5 min。

1.2.5琼脂糖凝胶电泳取10 μL扩增产物,置于15 g/L琼脂糖凝胶中电泳,用goldview染色,DNA Marker定位,在紫外线灯下观察是否扩增出目的条带。若用甲基化特异性引物(M)扩增出片段,则说明被检测序列存在甲基化(MM);若用非甲基化特异性引物(U)扩增出片段,则说明被检测序列不存在甲基化(UU);若用两套引物同时扩增出条带,则说明该检测序列呈部分甲基化状态(UM)。

1.3统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析,所得计量数据以±s表示,组间比较采用t检验,计数数据组间比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

子痫前期组和正常妊娠组孕妇CTGF基因部分甲基化阳性率分别为10.0%和8.5%,两组差异无显著性(P>0.05);子痫前期组和正常妊娠组孕妇CTGF基因甲基化阳性率分别为22.2%和38.3%,两组间差异有显著性(χ2=5.517,P<0.05)。子痫前期组和正常妊娠组孕妇CTGF基因总甲基化阳性率分别为32.2%和46.8%,子痫前期组甲基化水平低于正常对照组,差异有统计学意义(χ2=4.087,P<0.05)。见图1、表3。

3讨论

子痫前期是一种严重的妊娠期特发性产科并发症,可导致母体多系统不可逆损伤以及胎儿生长受限,是造成孕产妇和围生儿发病率及死亡率增加的主要原因之一[1]。文献报道,目前国外子痫前期的发病率为7%~10%[16-17],而我国约为9.4%[18],其死亡率占发病率的15%左右[19]。子痫前期是我国孕产妇死亡的第二大原因。临床上,子痫前期既可表现为母体综合征,又可表现为胎儿综合征[20]。子痫前期期待治疗效果甚微,目前唯一治疗手段是终止妊娠。因此,寻找能够诊断和治疗子痫前期的有效手段是临床上亟待解决的问题。

目前,子痫前期的发病机制学说众多[2],尚无定论,但多数学者认为遗传因素是子痫前期发生的根本原因,其中与子痫前期发病相关的易感基因及表观遗传因素在该病的发生发展中发挥重要作用[21]。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的催化作用下,将S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基基团共价结合到CpG二核苷酸的胞嘧啶5′碳位上的过程,最终导致转录抑制及表型改变[6]。有文献报道,异常的全基因组甲基化以及CpG岛甲基化与许多子痫前期重要功能基因表达异常有关,推测甲基化修饰参与调控了子痫前期的发生[7]。

CTGF是一种富含半胱氨酸的分泌肽,由349个氨基酸组成,分子量为34 000~38 000,是CCN家族的成员之一[8]。CTGF最早是作为促进纤维化的重要蛋白而被认识的[22],其作为转化生长因子-β(TGF-β)的下游信号分子,参与调节与纤维化相关的生物学过程。近几年研究发现,CTGF蛋白还是一种有效的血管生成诱导剂[23],具有促进血管生成、诱导细胞增殖、介导细胞黏附、刺激细胞迁移的功能,还可通过调控基质金属蛋白酶及其抑制剂的表达参与细胞外基质重塑[13,24]。MSP是一种用于检测基因甲基化的经典方法,其原理为:首先用重亚硫酸氢盐处理基因组DNA,经处理后所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则保持不变,然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物,进行PCR扩增,通过琼脂糖凝胶电泳检测MSP扩增产物,确定被检测DNA序列的甲基化状态[15]。本研究采用MSP方法,对90例子痫前期病人及94例正常妊娠者外周血中CTGF基因启动子区甲基化水平进行检测。检测结果显示,子痫前期组和正常妊娠组孕妇CTGF基因总甲基化阳性率分别为32.2%和46.8%,子痫前期组甲基化水平低于正常对照组,差异有显著意义。提示子痫前期病人CTGF基因启动子区呈异常的低甲基化状态。CTGF基因启动子区低甲基化可致该基因表达上调,使胎盘组织及母血中CTGF的表达量增多,导致胎盘损伤进而引发子痫前期。本文结果表明,子痫前期的发生与CTGF基因启动子区的甲基化状态有关,这初步揭示了子痫前期在表观遗传方面的发病机制,为预测子痫前期和实现子痫前期的早期筛查提供了新思路。

目前关于CTGF与子痫前期发病关系的文献报道还比较少,CTGF和TGF-β1在子痫前期发病中的相互作用机制还不清楚。今后我们将进一步开展体外和体内实验,探讨CTGF在胎盘绒毛外滋养细胞侵袭、重塑及血管新生方面的作用机制,以期为临床诊断和治疗子痫前期提供实验依据。

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