[摘要] 目的 檢测UNR基因在上皮性卵巢癌细胞中的表达，并观察其对卵巢癌细胞上皮间质转化（EMT）的影响。 方法 采用实时荧光定量PCR（qPCR）检测并比较体外培养的人上皮性卵巢癌细胞系SKOV-3、HO-8910、ES-2和永生化人卵巢上皮细胞系MOODY中UNR基因的表达，采用qPCR和Western blot检测卵巢癌SKOV-3细胞的UNR-RNAi干扰效率，应用Transwell侵袭小室实验检测SKOV-3细胞的侵袭能力，采用Western blot检测SKOV-3细胞E-cadherin的蛋白表达。 结果 UNR在上皮性卵巢癌细胞系SKOV-3、HO-8910、ES-2中均有显著表达。shUNR转染SKOV-3后，Transwell侵袭小室实验显示，UNR-RNAi组穿膜细胞数为每视野（29.33±5.14）个，显著低于阴性对照组（76.00±5.42）个（P < 0.01）。此外，Western blot显示UNR基因干扰后SKOV-3细胞中E-cadherin的蛋白表达显著上调。 结论 shUNR可以抑制卵巢癌SKOV-3细胞UNR基因的表达，降低卵巢癌细胞的侵袭能力。干扰后E-cadherin的表达上调提示UNR可能促进卵巢癌EMT的发生，以UNR基因为靶点的干扰技术有望成为卵巢癌治疗的新策略。
[关键词] RNA干扰；卵巢癌；UNR；上皮间质转化
[中图分类号] R737.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）10（c）-0021-05
Role of UNR in regulating the epithelial mesenchymal transition of epithelial ovarian cancer cells
WENG Jiaong MIAO Yi SUN Yunyan
Department of Gynecology and Obstetrics， the First People′s Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200080， China
[Abstract] Objective To detect the expression of UNR gene in epithelial ovarian cancer cells， and to observe the effect of UNR gene on epithelial mesenchymal transition （EMT） of ovarian cancer cells. Methods Real-time quantitative PCR （qPCR） was used to detect and compare the expression of UNR gene in human epithelial ovarian cancer cell lines SKOV-3， HO-8910， ES-2 and immortalized human ovarian epithelial cell lines MOODY in vitro. qPCR and Western blot were used to detect the UNR-RNAi interfering efficiency of ovarian cancer cell SKOV-3， the invasion ability of SKOV-3 cells was detected by Transwell invasion assay. The protein expression of E-cadherin in SKOV-3 cells was detected by Western blot. Results UNR was significantly expressed in the epithelial ovarian cancer cell lines SKOV-3， HO-8910 and ES-2. After SKOV-3 was transfected by shUNR， Transwell assay showed that the number of transmembrane cells in UNR-RNAi group was （29.33±5.14） per field， which was significantly lower than that in negative control group [（76.00±5.42） per field] （P < 0.01）. In addition， Western blot showed that the expression of E-cadherin protein in SKOV-3 cells was significantly up-regulated after UNR gene interference. Conclusion shUNR can markedly inhibit the expression of UNR gene in ovarian cancer SKOV-3 cells， decrease the invasive ability of ovarian cancer cells. The up-regulated expression of E-cadherin after interference shows that UNR may promote the occurrence of ovarian cancer EMT， thus， the interfering technology taking UNR gene as target is expected to become a new strategy for the treatment of ovarian cancer.
[Key words] RNA interference； Ovarian cancer； UNR； Epithelial mesenchymal transition
卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤，起病隐匿，易转移复发，5年生存率仅为30%。上皮间质转化（EMT）是影响卵巢癌发生发展的重要因素，所以探讨卵巢癌EMT的相关机制有着重要的临床意义。本研究所研究的UNR/CSDE1（upstream of N-ras）基因是冷休克蛋白家族的成员之一，是由5个冷休克结构域（cold-shock domains，CSDs）组成的单链核苷酸结合蛋白，在哺乳动物中位于N-ras基因的上游130～150个核苷酸距离处[1]，UNR既可以促进也可以抑制转录[2]。Wurth等[3]研究发现UNR在黑色素瘤细胞里表达丰富，是RNA上游调节子，能促进黑色素瘤细胞的侵袭和转移。本研究通过探讨UNR基因在上皮性卵巢癌中与EMT的关系，以期阐明UNR基因在卵巢癌侵袭转移中的作用机制，旨在为卵巢癌的诊断和治疗提供新的研究方向。
1 材料与方法
1.1 细胞系
人类上皮性卵巢癌细胞系SKOV-3、HO-8910、ES-2和永生化人卵巢上皮细胞系MOODY：由上海交通大学附属第一人民医院妇产科实验中心提供。
1.2 shRNA
UNR-RNAi慢病毒重组颗粒购自上海吉凯基因化学技术有限公司。UNR-RNAi根据基因库NCBI中人UNR/CSDE1 mRNA序列（NM_001007553.2、NM_ 001 130523.2、NM_001242891.1、NM_001242892.1、NM_ 001242893.1、NM_007158.5）设计一对特异性的小分子干扰片段，UNR-RNAi基因序列：5′-GAGATGATGTTGAATTTGACTCGAGCTCGAGTCAAATTCAACAT？鄄CATCTC-3′。阴性对照siRNA序列：5′-TTCTCCGA？鄄ACGTGTCACGT-3′。
1.3 試剂
FBS购自上海微科生化试剂有限公司；DMEM培养基购自美国Hyclone公司；TRIzol购自上海普飞公司；Promega M-MLV试剂盒购自美国Promega公司；SYBR Master Mixture购自日本TAKARA公司；病毒感染试剂ENi.S.和Polybrene购自上海吉凯基因化学技术有限公司；兔抗人UNR抗体和兔抗人E-钙黏素（E-cadherin）抗体购自英国Abcam公司；辣根过氧化物酶（HBP）标记的抗兔二抗IgG购自美国Santa Cruz公司；人工基底膜基质凝胶Martrigel和Transwell小室购自美国Corning公司。
1.4 方法
1.4.1 qPCR检测各卵巢癌细胞系中UNR mRNA的表达 各卵巢癌细胞和MOODY细胞置于含有10%FBS的DMEM培养液中，于37℃、5%CO2条件下培养，取对数生长细胞进行实验。收集细胞，按TRIzol试剂盒说明书抽提细胞总RNA，取2.0 μg总RNA反转录成cDNA。UNR基因引物序列：上游：5′GAAGATGTCGA？鄄AGGGAACG3′，下游：5′GCGAGCACTTACAGCACCA3′；内参基因磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH引物序列：上游：5′TGACTTCAACAGCGACACCCA3′，下游：5′CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA3′，以此为模板进行PCR扩增。采用12 μL反应体系：SYBR Premix Ex Tap 6 μL，上下游引物（5 μmol/L）各0.5 μL，模板1.0 μL，RNase-Free H2O 4.0 μL。反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火延伸30 s，40个循环。实验所获得的数据采用Ct值（2-ΔΔCt法）进行相对定量分析。
1.4.2 shUNR重组慢病毒颗粒感染卵巢癌细胞系SKOV-3 选取表达最丰富的SKOV-3细胞作为目的细胞，取对数生长期细胞进行实验，细胞密度约80%汇合时应用病毒感染试剂ENi.S.和Polybrene转染shRNA。分组如下：①干扰组（UNR-RNAi组）：感染了UNR-RNAi；②阴性对照组（NC组）：感染了阴性对照siRNA。感染后72 h收集细胞，同时荧光显微镜观察细胞病毒感染情况并予拍照，荧光率即为阳性感染率。
1.4.3 检测卵巢癌SKOV-3细胞的UNR-RNAi干扰效率 qPCR检测方法同“1.4.1”。Western blot检测如下：提取各组细胞总蛋白，蛋白定量后，采用10% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，将凝胶上的蛋白质转移至PVDF膜上，封闭2 h后加入相应的一抗和二抗，反应、洗膜、ECL曝光、显影、洗片、拍照。以GAPDH为内参照。
1.4.4 Transwell侵袭小室实验检测侵袭能力的变化 在Transwell上室铺Martrigel 60 μL。收集三组对数生长的细胞，重悬后细胞密度为105/mL，取500 μL加入Transwell上室，下室加入750 μL含30% FBS的培养液作为趋化因子，培养48 h后取出小室，用棉拭子轻轻拭去小室内非侵袭细胞，滴2～3滴Giemsa染色液染色3～5 min后，冲洗、晾干、观察并拍照，每片膜随机计数9个视野内的穿膜细胞数，计算平均值，每组设3个复孔。
1.4.5 Western blot法检测SKOV-3细胞E-cadherin的蛋白表达 实验方法同“1.4.3”中的Western blot实验。
1.5 统计学方法
所有数据采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 qPCR检测各卵巢癌细胞系中UNR基因的表达
qPCR显示，UNR基因在人上皮性卵巢癌细胞系SKOV-3、HO-8910和ES-2中表达丰富。SKOV-3、HO-8910、ES-2的相对表达量（2-ΔΔCt）分别为（3.484±0.129）、（1.136±0.039）、（1.519±0.115），均高于MOODY细胞系（1.000±0.024），差异均有高度统计学意义（P < 0.0001、P = 0.0069、P = 0.0016）。见图1。
2.2 卵巢癌SKOV-3细胞UNR-RNAi干扰效率的检测
图2A是SKOV-3细胞感染UNR-RNAi病毒72 h后的图片。qPCR显示，NC组和UNR-RNAi组的UNR的相对表达量（2-ΔΔCt）分别为（1.002±0.073）、（0.133±0.005），差异有高度统计学意义（P = 0.0022）（图2B），干扰效率达86.7%；Western blot显示，与NC组比较，UNR-RNAi组UNR蛋白表达显著下调（图2C），与mRNA的变化一致，说明UNR-RNAi有效抑制了SKOV-3细胞的UNR基因，可用于后续检测。
A：SKOV-3细胞感染病毒72 h后的图片；B：qPCR检测UNR-RNAi病毒干扰效率，**P = 0.0022；C：Western blot检测病毒干扰后UNR蛋白的表达，1～3为NC组，4～6为UNR-RNAi组，每组3个复孔，实验重复3次
2.3 Transwell侵袭小室实验检测细胞侵袭能力的变化
Transwell侵袭小室实验结果显示，UNR-RNAi组平均每个视野中的穿膜细胞数为（29.33±5.14）个，显著低于NC组[（76.00±5.42）个]，差异有高度统计学意义（P = 0.0004）。
2.4 Western blot检测SKOV-3细胞E-cadherin的蛋白表达
Western blot显示，UNR-RNAi组中SKOV-3细胞E-cadherin的蛋白表达较NC组显著上调（图4）。
3 讨论
上皮性卵巢癌是最常见的病理组织类型，侵袭度高，主要在形态学和分子学上发生了一系列改变，包括上皮细胞失去极性，细胞间连接减少，获得间质细胞特性，从而能够适应盆腹腔广泛转移，这即为EMT。EMT可以驱动侵袭的发生[4]，从而引起肿瘤进展。
本研究中的UNR属于RNA结合蛋白（RBP），RBPs是调控肿瘤特征的关键性因子，可以调控基因转录后的各步骤[5]。UNR/CSDs冷休克结构域由70个氨基酸残基组成，在进化过程中高度保守[6]。在真核生物中，冷休克蛋白与其他相关蛋白共同作用于转录调节，在胞浆中影响mRNA的翻译从而调控生长发育和应激反应[6-8]。有报道UNR参与内部核糖体进入位点序列（internal ribosome entry sites，IRES）介导的翻译过程[9-11]，包括编码癌基因MYC、PITSLRE细胞周期激酶、APAF-1细胞凋亡调控因子[11-12]。同时UNR又可以通过细胞内自身含量的变化负反馈抑制IRES介导的翻译过程的启动[13]。分析发现果蝇的UNR与数百种转录有关[14]，其中有许多编码调控因子的mRNA与人类肿瘤的发生有关，比如TGFB1、ABL1、CTNNB1等。这些研究提示UNR与肿瘤的发生发展和增殖有关。Wurth等[3]研究发现UNR是包括RAC1和VIM在内的RNA癌基因的调节子，控制PTEN mRNA水平，调节肿瘤的侵袭和转移。
N-ras基因在卵巢癌发生发展中的作用已被很多研究证实，UNR基因作为N-ras的上游因子，是否也对卵巢癌的发生起到了调控作用？是否参与了卵巢癌EMT的发生？又是通过怎样的途径引起的？基于这此疑问，本研究测定了卵巢癌细胞中UNR的含量，并对其进行干扰，来判断UNR与卵巢癌EMT的关系。
实验结果显示，UNR基因在人上皮性卵巢癌细胞系SKOV-3、HO-8910和ES-2中的表達丰富，与MOODY细胞系比较，差异有统计学意义，这一实验结果提示UNR基因可能与上皮性卵巢癌的发生发展有关。选取UNR基因表达丰富的SKOV-3细胞，用shUNR感染这株细胞，检测UNR-RNAi干扰效率。结果显示，UNR mRNA的表达水平显著下降，干扰效率达86.7%，差异有高度统计学意义（P < 0.01），与之相应UNR蛋白表达也显著下降。说明所制备的UNR-RNAi有效地干扰了卵巢癌细胞UNR基因的表达，为后续卵巢癌细胞的功能实验做好了准备。
恶性肿瘤一个最为重要的生物学特征是侵袭和转移，EMT参与了肿瘤发生发展的过程。而EMT最显著的特征是E-cadherin表达的丢失[15-16]，E-cadherin水平下降可以导致细胞的黏附能力降低，使细胞获得易于侵袭和转移的特性。Transwell侵袭小室实验发现，UNR-RNAi能使SKOV-3细胞通过小室基质胶的能力明显降低，与NC组比较，UNR-RNAi组穿膜细胞数显著下降，差异有高度统计学意义（P < 0.01），提示UNR基因促进了卵巢癌细胞的侵袭能力，这一结果与Wurth等[3]发现一致。Western blot实验发现UNR基因干扰后卵巢癌细胞E-cadherin蛋白含量升高，进一步证实了UNR促进卵巢癌的侵袭是通过EMT来实现的，UNR促进了上皮性卵巢癌EMT的发生。
综上所述，上皮性卵巢癌细胞中UNR高表达，且促进卵巢癌的侵袭和转移。通过靶点shRNA干扰UNR后，抑制了UNR基因表达，通过增加E-cadherin的表达，降低卵巢癌细胞的侵袭能力，最终抑制卵巢癌EMT的发生。通过RNA干扰的方法抑制UNR基因调控，为卵巢癌的治疗提供新的思路。
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（收稿日期：2017-07-12 本文編辑：张瑜杰）
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