摘要 细胞内钙离子是一个重要的第二信使，调节多种细胞功能。卵子受精激活是一个重要的钙依赖性现象，在受精时，精子不仅提供了一半的基因组，而且能够激活卵子，减数分裂的阻滞释放被称为“卵激活”，以极体与雌雄原核的形成为特点。目前已知的所有动物中，卵子受精时细胞内共同出现一个钙离子浓度显著增加的现象，这一卵激活中关键信号的特点是减数分裂的恢复和原核的形成。
关键词 卵子激活；钙离子振荡；精子因子；PLCζ
中图分类号 Q954.4 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）16-0257-03
哺乳动物卵子在受精过程中，钙离子也参与其中并具有很重要的作用。在哺乳动物卵子中，由于内质网通过1型1，4，5 -三磷酸肌醇（IP3）受体释放钙离子，使得受精过程中卵内钙离子多次有规律的跃升（钙离子振荡）[1]伴随着每个跨卵波传播的发生得以实现。自1974年Steinhardt等人首次表明钙离子载体A23187能够激活仓鼠卵后，越来越多的试验证明，细胞内钙离子上升是卵激活必要和足够的因素。迄今为止，有2种假说解释钙离子振荡的机制，一种是受体假说，另一种是融合假说。前者认为精子通过活化卵子膜表面的受体从而激活磷酸肌醇信号通路诱导钙离子振荡的发生；后者认为精子的激活因子是钙离子振荡的触发信号，并引出了钙离子诱导蛋白COIP的概念。目前PLCζ由于其极高的钙离子灵敏度作为假定的COIP已经得到了很大的关注。还有研究指出卵激活的中央分子是成熟促进因子MPF，它使脊椎动物成熟卵子在第2次减数分裂中期被阻止。该文系统地阐述了目前关于受精过程中钙离子振荡的主要机制，目的是使读者能客观地分析精子因子/卵子中钙离子增加/卵激活等的内在联系，并向尚未完全清楚的方向展开研究。
1 钙离子假设
钙离子作为一个卵激活信号的概念，是从20世纪30年代初出现在人工诱导激活试验中的，并且在40年后钙离子假设被证实。1974年，Steinhardt等人表明，钙离子载体A23187能够激活海胆、海星、蟾蜍和仓鼠卵。1977年，一个显著的细胞内钙离子上升，首次在使用了钙结合荧光水母蛋白的鳉鱼和海胆的受精卵中被记录到。此外，将钙离子缓冲液注射到卵中可以诱导卵激活，并在细胞内钙离子的增加由预先注射的钙螯合剂EGTA阻断时被阻止。因此，细胞内钙离子上升作为受精后早期胚胎发育的级联的初始步骤被认为是卵激活必要和足够的因素。后来广泛的研究已经证明，钙离子依赖的卵激活在动物王国是非常普遍的。1978年，Gilkey等人第1次显示了图像，钙离子波从精子的融合开始并以大约10 μm/s的速度传播至整个青鳉卵（直径约1 mm），这符合一种皮质颗粒胞吐方式。钙离子波不会受到外部钙离子影响，表明细胞内钙离子上升是由于细胞内钙离子释放所致。其传播性质是被一个以正反馈系统为基础的“钙离子诱导钙释放”（CICR）所介导，是在肌肉细胞的肌浆网中被发现的。至于钙离子从内质网中释放的机制，三磷酸肌醇受体（IP 3R）/钙离子途径参与所有物种，显示钙波取决于其抑制剂肝素，或更具体地说，是哺乳动物卵子中一种对抗1型IP 3R的单克隆抗体18A10[2]。因此，三磷酸肌醇引起的钙释放（IICR）在受精时的钙离子应答中发挥了重要作用[3]。钙离子本身是一个激活的IP 3R，并且在平滑肌细胞中三磷酸肌醇引起的钙释放的速度被浓度为100 nmol/L（静止状态时的细胞内钙离子浓度）到300 nmol/L的钙离子加强。这表明钙波被一种全或无的方式，即通过向缺乏兰尼碱受体的金黄地鼠卵胞浆中注射钙离子所诱导。1986年，细胞内钙离子上升直接被钙离子敏感的微电极和水母发光蛋白记录出来，并且重复钙离子波也用超感光的照相机系统显示出来。后来钙波开始出现于植物半球，不论是在精子融合位点或在海鞘卵内质网中植物极附近某些起搏器丰富的地区。三磷酸肌醇引起的钙释放对于细胞内钙离子浓度的钟形依赖很可能就是内质网瞬间重复释放钙离子的基础。基于三磷酸肌醇引起钙释放的单钙离子池模型和钙涌入，可以解释频繁发生钙离子振荡后不断供应肌醇的现象（钙池操纵性钙内流）。有研究表示，在哺乳动物卵母细胞成熟的过程中SOCE（钙池调控钙离子进入）下调是一个至关重要的因素，它决定了特定受精的钙离子瞬态、卵激活和早起胚胎发育[4]。
2 精子因子假说
受精时信号转导通路导致三磷酸肌醇引起的钙释放自20世纪80年代中期就是一个中心主题。目前已有较为重要的证据证实了精子激活因子的存在。1990年，Swann研究发现将仓鼠精子提取物注射到卵子中能够诱导钙离子振荡。在小鼠卵中，仓鼠精子提取物引发的钙离子峰比在受精时拥有更高的频率。尽管钙离子峰值频率存在差异，但这一发现引发精子因子的假说，钙离子振荡诱导蛋白（COIP）在精卵融合时被引入卵子细胞质。COIP的预测非常重要，因为它意味着精子源性卵激活因子的存在。这个想法被以下结果强化：钙离子振荡是由人卵中胞浆内单精子注射引起的，卵胞浆内单精子注射技术，是现代一种强大的治疗不育的技术。也就是说，如果一个辅助生殖技术的使用，即使没有任何精子和卵子表面相互作用，受精也是可能的。1990年以来研究都聚焦在通过分离和纯化精子提取物的方法鉴定钙离子振荡诱导精子蛋白，关于通过注射一部分精子蛋白进入卵子进行钙离子振荡的生物活性测定。但是通过这种方法钙离子振荡诱导蛋白还没有得到决定性的证实。另一种方法是基于这样的假设，即PI途径相关的任何信使系统可能涉及。有研究认为精子因子的出现刺激三磷酸肌醇受体，至少在注入肝素的卵母细胞中，精子因子诱导的钙离子振荡被延迟或者被阻止[5]。也有试验表明，精子因子可以降低肝素竞争性抑制IP3的能力，推测精子激活因子可能通过提高卵子胞内钙离子释放通道（如IP3受体）的敏感性来诱导钙离子振荡的发生，而IP3的产生可能不参与这一过程[6]。除了精子因子假说外，目前还有钙离子在小鼠卵母细胞中的体内平衡机制等新的研究，如细胞质外的钙离子运输至内质网的机制等[7]。
3 钙离子振荡诱导PLCζ活性
磷脂酶C是钙离子振荡诱导蛋白的最主要的候选者[8]。实际上已知磷脂酶Cβ1，γ1，γ2，δ1，δ4在哺乳动物的精子中表达。然而，重组磷脂酶Cβ1，γ1，γ2和δ1等均未能引起卵胞浆内钙离子释放或造成钙离子仅在极其高的剂量中释放。在2002年，Saunders等发现磷脂酶C的一种新的同工酶PLC-ζ，它仅特异表达在老鼠精子中。他们还提出，将cRNA编码的PLCζ注入到老鼠卵中可以产生与受精时相似的钙离子振荡，此外，当精子提取物中的PLCζ免疫枯竭时钙离子振荡诱导活性丢失。因此，PLCζ作为假定的COIP已经得到很大的关注[3]。在小鼠卵中，通过将注入cRNA编码的PLCζ与荧光蛋白“金星”融合，使研究人员能够监控小鼠卵中的PLCζ的表达水平和分布。发现钙离子峰值的频率由于PLCζ不断表达在这个试验中而在逐步增加。Kouchi等人使用杆状病毒/Sf9-细胞表达系统成功地合成了功能性的PLCζ。显微镜下将重组PLCζ蛋白注入老鼠卵中可以诱导连续的钙离子峰，非常类似于那些注入精子提取物后产生的。但PLCζ的激活机制至今仍是未知的，有必要了解PLCζ如何经历活化状态产生IP3的。通常已知的PLC酶活性是通过增加钙离子浓度而增强的。PLCζ活动最大时的钙离子浓度为1 μmol/L，即受精小鼠卵中钙离子振荡时每个钙离子峰都达到细胞内钙离子浓度峰值水平。PLCζ的半数有效浓度为52 nmol/L，比起PLCδ1它约有100倍高的钙离子灵敏度。PLCζ的PIP2-水解活性中如此高的钙离子灵敏度是精子因子一个适合的特点，可以使其在受精时打入卵子。首先，触发钙离子释放前细胞内没有任何钙离子上升，并且在受精后保持持久的钙离子振荡。PLCζ基因目前已成功被克隆在小鼠、大鼠、狗、猪、牛、猴子和人类。最近的一个有关钙振荡诱导活性耦合串联质谱分析表明，核周基质中的活性成分与PLCζ相一致。重要的是阐明在不久的将来PLCζ是否能作为COIP在哺乳动物生理受精的卵子中运行。这个试验应用了被转基因RNA干扰的PLCζ，显示了转基因小鼠精子中PLCζ的减少和受精卵子中钙离子峰数目的减少。由于钙离子峰值的数目往往受体外受精试验条件的影响，所以最理想的是能够表明通过敲除PLCζ基因，受精时的钙离子振荡可以被完全阻断。不过精子因子假说的证据目前仅仅积累在海鞘，并且进一步探究PLCζ分子结构基础上的活化和改良机制也是必要的，PLCζ打入到卵胞浆中可能需要一些卵细胞因子的援助，例如由于PLCζ缺乏PH结构域，所以卵子因子可以促进PLCζ打入到胞浆中。此外，另有证据表明卵丘细胞中的钙离子动员对生殖细胞的发育和功能是十分重要的[9]。PLCζ可能应用于畜牧业的人工卵激活，在临床医学中PLCζ可以被用来作为一种辅助生殖技术。
4 信号从细胞内钙离子上升到卵激活
下游信号的细胞内钙离子浓度上升导致卵激活是另一个重要的课题。在不同物种细胞内钙离子增加可以诱导皮质颗粒胞吐，通常情况是在分泌细胞。在哺乳动物中，皮质颗粒的丢失是因为胞吐分泌的增多取决于钙离子峰值的数目。透明带中的释放物质即修饰蛋白，围绕在卵的周围（透明带反应），导致了多精块的形成。细胞内钙离子上升触发恢复减数分裂，第二极体形成，随后雌雄原核形成。卵激活的中央分子是成熟（或中期）促进因子（MPF：Cdk1/cyclin B1复合物），一种普遍存在的细胞周期调节因子。借助于细胞生长抑制因子（CSF）而持续活动的成熟促进因子使脊椎动物成熟的卵子在第2次减数分裂中期被阻止。作为泛素/蛋白酶体介导的细胞周期蛋白B1降解的结果，卵子被释放。受精时的钙离子应答与泛应素/蛋白酶体的活动相关。基于在受精时细胞内钙离子的上升，钙离子与钙调蛋白结合，从而激活钙调节蛋白依赖性激酶II（CaMKII）。在受精的小鼠卵中，钙调节蛋白依赖性激酶II的激活发生在每个钙离子峰。受蛋白水解作用，E3泛素连接酶使细胞周期蛋白B1聚泛素化。这个过程被集落刺激因子阻止。蛋白酪氨酸激酶信号被认为是上游通路的重要组成部分，即在从外部受精动物的卵母细胞中刺激钙释放，但在哺乳动物内部受精中类似的途径还没有被发现[10]。在哺乳动物中，钙调节蛋白依赖性激酶II抑制集落刺激因子，并代理其假定成分Emi1、Mad2或Bub1（c-mos-MAPK（促蛋白激酶）途径的最下游组件）。受精时重复的细胞内钙离子升高必须完成促成熟因子的降解。如果钙离子峰值的数目不足，在有丝分裂后期受精的卵子形成第二极体后被逮捕并不能形成原核。小鼠卵中长效钙离子振荡负责原核的形成，足够数量的钙离子峰造成MAP激酶活性的减低，从而导致原核的形成。还有报道关于钙离子振荡的频率和振幅影响兔胚胎发育的进程，例如致密化、囊泡的形成和移植4-细胞期胚胎到母体的成功率。
尽管有1个世纪的研究历史，但受精机理仍尚未完全明了。在此描述的精子因子/卵子中钙离子增加/卵激活是受精时细胞信号的主要观点，并且在哺乳动物中这方面的研究目前是最先进的。进一步了解参与受精的机制和早期胚胎发育取决于未来的研究。
5 参考文献
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