ＥＡＥ大鼠第四脑室外侧隐窝凋亡细胞的研究

【摘要】目的观察凋亡细胞在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠第四脑室外侧隐窝的变化,探讨该部位结构与免疫调节的关系｡方法建立急性EAE大鼠模型,应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)技术检测细胞凋亡｡结果EAE时外侧隐窝凋亡细胞具有明显的时程特异性｡结论该部位免疫反应强烈,为一敏感区｡

【关键词】实验性自身免疫性脑脊髓炎;第四脑室外侧隐窝;凋亡细胞

实验性自身免疫性脑脊髓炎是一种T细胞介导的中枢神经系统(CNS)自身免疫性疾病｡近年来研究发现,细胞凋亡与EAE发病有关,尤其在EAE愈复和免疫耐受形成中起重要作用^[1-2]｡EAE时脑凋亡细胞的研究报道较少,而应用TUNEL技术对脑室周器官及第四脑室外侧隐窝进行凋亡细胞研究未见报道｡该研究应用TUNEL技术,在EAE大鼠模型的不同时程,观察外侧隐窝凋亡细胞的数量､分布,并结合组织结构的变化,探讨该部位结构与免疫调节的关系｡

1材料与方法

1.1材料

本研究用雌性Wistar大鼠(体重200g±20g)24只,豚鼠(400g±20g 性别不限)5只｡动物由河北省动物实验中心提供｡光镜观察组和TUNEL实验观察组各12只,分别分为正常对照､EAE潜伏期(7d)､发病极期(14d)､恢复期(21d)各3只进行实验｡TUNEL试剂盒购自北京中山公司｡

1.2方法 

1.2.1EAE模型的制备及评分标准按照曹翠丽^[3]等建立EAE模型的方法,制成急性EAE大鼠模型｡对照组大鼠不做任何处理｡

1.2.2取材及样品制备分别将对照和实验组大鼠于免疫后7､14､21d分批进行麻醉､灌注､取脑块(第四脑室外侧隐窝处)后固定､常规石蜡包埋､切片厚5μm､漂浮法贴片｡进行常规HE染色制备切片｡TUNEL样品制备:梯度酒精置换､蛋白酶K消化､0.3%H2O2甲醇液室温孵育､冰上孵育后,加上TUNEL反应液50ul,在湿盒中37℃下孵育1h,加入50ul转化剂- POD,在湿盒中37℃下孵育30min,加入底物DAB溶液,室温下孵育10min｡标记过程中,每步间用PBS冲洗｡脱水､透明､苏木素复染､封片｡室温风干后,显微镜观片,OLYMPUS万能显微镜照相｡

1.2.3统计学处理所有数据输入SAS6.12统计软件,采用配伍组设计方差分析,任意两组之间的比较采用q检验｡

2结果

2.1光镜观察结果

正常对照组大鼠第四脑室外侧隐窝室管膜细胞呈单层,细胞排列稀疏｡潜伏期室管膜细胞呈单层排列密集,室管膜下组织疏松,血管丰富､扩张｡发病极期室管膜细胞排列更加密集､呈多层排列,室管膜下见极度水肿,室管膜层与其下层有部分分离,血管周围及室管膜下有大量的炎性细胞浸润(图1)｡ 恢复期组较发病极期组水肿明显消退｡

2.2TUNEL方法检测结果

对照组外侧隐窝室管膜及室管膜下未见TUNEL阳性细胞;潜伏期出现TUNEL阳性细胞;并随病情进展增多,至疾病高峰期,室管膜及室管膜下､血管周围区TUNEL阳性细胞达最高水平(图2);恢复期TUNEL阳性细胞数量较高峰期递减;在恢复期同一蜡块相邻部位切片作TUNEL阴性对照,未发现TUNEL阳性细胞(图3､4)｡

2.3在外侧隐窝室管膜区域随机观察五个视野,统计阳性细胞数见表1｡经统计学处理:EAE实验组与正常对照组比较差异均有显著性(P<0.01);14d组与7d组和21d组比较有显著性差异;7d组与21d组比较无差异｡ 

3讨论

3.1从病理变化看,EAE大鼠外侧隐窝室管膜及室管膜下在不同时程有明显的变化｡这种病理变化与临床症状的变化完全一致｡该研究发现,EAE大鼠中的凋亡细胞在该部位具有明显的时程特异性,这种凋亡细胞数量变化趋势与陈慧芳^[2]等EAE大鼠TUNEL阳性细胞的研究是一致的｡从凋亡细胞的分布规律看,凋亡细胞主要在室管膜及室管膜下血管周围区分布,较其他区域分布多｡

3.2本实验是通过大鼠足垫内注射抗原来诱导EAE发病｡首先激活血液中的自身反应性T淋巴细胞^[4],由于CNS有相对严密的脑屏障保护,所以应免于受难｡但EAE是局限在CNS内的以炎性脱髓鞘为特征的自身反应性疾病,已报道T淋巴细胞可以通过多种机制经BBB入脑,进而引起炎性反应｡BBB通透性的改变是较早的病理改变,在发病极期通透性改变最显著^[5]｡我们推测,第四脑室外侧隐窝室管膜下层血管丰富,可能在发病的早期接触血携免疫信息分子,激活具有吞噬功能的小胶质细胞,集于血管周围,使脑处于防御警戒状态,随着病程发展,血管扩张､通透性增加,大量炎性细胞浸润,活化小胶质细胞巨噬细胞分泌的神经毒性物质和细胞因子诱导T细胞凋亡,同时为了自身内环境的稳定而走向凋亡,在发病的极期达到最多,巨噬细胞凋亡和T细胞凋亡均有助于EAE的下调^[6],有利于疾病的恢复｡

在EAE发病过程中,第四脑室外侧隐窝在不同时程凋亡细胞的变化趋势及病理改变,表明该部位在EAE时免疫反应剧烈,为一特殊敏感区｡

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