侧脑室注射醒脑静对脑出血大鼠TLR4及炎性因子表达的影响

材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和分组 体重为280～300 g清洁级健康雄性SD大鼠，由广西医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（桂）2014-0002。实验期间动物自由饮用自来水并进食标准颗粒饲料，术前8 h禁食水。将SD大鼠随机分成模型组、侧脑室组、静脉组和正常组，每组10只。

1.1.2 主要试剂 醒脑静注射液由无锡济民可信山禾药业股份有限公司提供，兔抗TLR4多克隆一抗、兔抗TNF-α多克隆一抗、兔抗IL-1β多克隆一抗由武汉博士德生物技术有限公司提供，SP法免疫组化试剂盒、DAB显色盒由北京中杉金桥有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 制备模型 采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，将其固定于立体定向仪上，根据《大鼠脑立体定位图谱》确定右侧尾壳核位置；在头皮正中切开约0.8 cm的切口，剪开骨膜，暴露前囟，于前囟前0.2 mm、中线右旁开3 mm处钻一直径为l mm的孔；用微量注射器经尾动脉采血50 μl后，固定于立体定向仪上沿针孔垂直进针，进针深度为6.0 mm（此为尾壳核的位置），注射时间2 min，留针10 min，缓慢退针。

1.2.2 药物干预 侧脑室组在大鼠脑缺血模型制备后，将其固定于定位仪上，切开皮肤，暴露颅骨，以前囟正中线后端为零点，选取向后1.0 mm、向左1.5 mm处为进针点，穿刺针进针4 mm，微量注射器左侧侧脑室注射10 μl/kg醒脑静注射液。静脉组在大鼠脑缺血模型制备后从大鼠尾静脉注射20 μl/kg的醒脑静。模型组、正常组均从大鼠尾静脉注射20 μl/kg的生理盐水。

1.2.3 神经功能缺损评分 动物苏醒后为第0 h，分别于第0、12、24、48、72 h采用Bederson法[6]对各组大鼠的神经功能缺损进行评分，具体内容如下。0分：未出现任何神经功能缺损症状；1分：提尾时病灶对侧的肢体屈曲内收；2分：一侧侧推抵抗力下降，同时伴有提尾时病灶对侧的肢体屈曲内收；3分：自由活动时向瘫痪侧划圈并伴有一侧侧推抵抗力下降；4分：意识丧失。

1.2.4 解剖、HE染色 于第72 h麻醉大鼠，经左心室依次灌注生理盐水、4%多聚甲醛，切取以针孔为中心的脑组织，完整保留出血灶及其周围，浸泡于4℃的4%多聚甲醛中固定24 h，逐级乙醇脱水、石蜡包埋、切片，再HE染色，观察血肿周围的炎性侵润情况。

1.2.5 免疫组化免疫组化 取上述包埋好的石蜡，4 μm连续切片作TLR4、IL-1β、TNF-α细胞免疫组化染色，按免疫组化SP法试剂盒说明书操作，阴性对照用PBS代替一抗。在光镜下进行观察，细胞质或细胞核出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。每只大鼠的脑组织各取3张切片，每张切片选取互不重复的5个视野（×200倍），采用Image-proplus 6.0软件测定每个视野的积分光密度值（IOD）和阳性面积（area），计算平均积分光密度（IOD/area）。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以x±s表示，采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，其中方差齐时采用SNK检验，方差不齐时采用Games-Howell检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组不同时间神经功能缺损评分的比较

造模后对各组不同时间段的神经功能缺损进行评分，正常组无神经功能缺损症状，模型组、静脉组和侧脑室组则出现明显的神经功能缺损症状，其中模型组在第48小时的评分最高，静脉组和侧脑室组在第24小时的评分最高。侧脑室组第24、48、72小时的评分显著低于模型组相同时间段的评分，差异有统计学意义（P<0.05）。侧脑室组第72小时的评分显著低于静脉组，差异有统计学意义（P<0.05）。静脉组第48、72小时的评分显著低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

2.2 各组HE染色结果的比较

各组的HE病理染色显示，模型组、静脉组和侧脑室组血肿周围均有不同程度的炎性细胞浸润及组织缺损，正常组无异常表现，模型组炎性侵润最重，侧脑室组炎性细胞浸润较静脉组轻（图1）。

2.3 各组TLR4、TNF-α和IL-1β平均积分光密度值表达的比较

模型组、静脉组和侧脑室组的TLR4、IL-1β和TNF-α平均积分光密度值显著高于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）。静脉组和侧脑室组的TLR4、IL-1β和TNF-α平均积分光密度值显著低于模型组，差異有统计学意义（P<0.05）。侧脑室组的TLR4和TNF-α平均积分光密度值均显著低于静脉组，差异有统计学意义（P<0.05）（表2，图2）。

3 讨论

血-脑脊液屏障对维持中枢神经系统正常生理状态具有重要的生物学意义[7]，但在脑损伤时，其也限制了药物的使用。目前的研究显示，在脑血管疾病锥颅血肿腔引流的同时给予侧脑室用药能明显改善神经功能症状[5]。临床研究显示，中药复方制剂醒脑静注射液对ICH具有良好的治疗作用[8]。药理学研究显示，该药具有除脑水肿、降低颅内压、改善大脑血氧供应、调节能量代谢、清除自由基反应及促进脑细胞康复等作用[9]，但是关于其侧脑室给药能否改善ICH神经功能缺损症状的研究相对缺乏。

大量的实验研究及临床观察显示，ICH发病后各种继发因素所致的脑水肿、出血灶周围炎症损害是导致脑组织损伤的主要病理机制[10]。通过干预炎性细胞因子的表达，能够在很大程度上促进ICH患者的病情康复，改善其预后[11]。本研究采用侧脑室注射醒脑静，观测其对ICH的保护作用。HE染色显示，侧脑室组血肿周围的炎性侵润较静脉组明显减少；神经功能缺损评分显示，通过侧脑室注射醒脑静能明显改善大鼠的神经功能缺损症状，提示醒脑静能有效抑制急性ICH所诱发的炎症反应，而侧脑室注射醒脑静能更有效地促进神经功能康复。

本研究结果显示，醒脑静干预能够明显减少TLR4的表达。此外，与静脉给药相比，侧脑室给药能够更有效地减少TLR4的表达。在炎性调控过程中，TLR4是胞内信号转导通路中最重要的上游调节靶点[12]，参与调控炎症反应和细胞凋亡等重要的病理生理过程[13]。大量实验研究显示，TLR4信号途径主要集中激活NF-κB，进而启动和放大炎症反应，导致多种炎症因子的瀑布式释放，最终产生损伤效应[14]。

ICH血肿周围的TNF-α和IL-1β是引起炎症反应的主要因子[15]。本研究免疫组化结果显示，侧脑室组血肿的TNF-α和IL-1β阳性细胞浸润较静脉组少，提示醒脑静侧脑室用药能够明显抑制TNF-α和IL-1β的表达。研究显示，TNF-α是ICH血肿周围大量表达的多效促炎因子，其在触发炎症反应及神經损伤中处于中心地位[16]，具有明显的神经毒性和加速细胞死亡作用[17]，能使血肿周围的炎症反应不断加剧，同时也能够破坏血-脑脊液屏障的完整性，使其通透性增加，进而导致脑水肿和脑细胞损害[18]。在ICH病理过程中，IL-1β能够激活血液中的白细胞[19]，使其经过一系列复杂的机制穿过血管内皮细胞游离至出血灶内及其周围，通过释放血栓烷素和内皮素等有毒物质加重血肿周围的继发性损害[20]。本研究结果显示，在大鼠ICH高峰期，醒脑静侧脑室用药能够明显减少TLR4、IL-1β、TNF-α炎性因子的表达，从而改善ICH后大鼠的神经功能，而IL-1β、TNF-α是TLR4下游调节因子[8]，由此推断醒脑静能通过调节TLR4炎性调节通路介导抑制ICH后的炎症反应。

综上所述，醒脑静能够抑制炎性因子的表达，促进ICH神经功能康复，而醒脑静侧脑室用药更能够明显地抑制CNS炎性浸润和血肿周围严重的炎性损伤，提示醒脑静侧脑室用药是促进ICH神经功能康复的有效用药途径，可能成为治疗ICH的新方法。由于ICH发病机制复杂及炎症反应的连锁效应，因此今后还需深入研究醒脑静侧脑室用药对CNS炎症反应的影响，以便为临床治疗ICH提供更有效的理论依据。

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（收稿日期：2015-05-08 本文编辑：祁海文）