材料与试剂
1.1.1 材料
菌种：白银赛诺公司产纤维素酶1#菌种;白银赛诺公司产纤维素酶2#菌种;白银赛诺公司产纤维素酶3#菌种。
酶制剂：里氏木霉产β-葡聚糖酶（酶活1 500万U/g）;里氏木霉产木聚糖酶（酶活200万U/g）。
实验原料：玉米、湿基玉米纤维皮、玉米皮、玉米芯、麸皮、玉米浆。
1.1.2 试剂
乙酸锌、亚铁氰化钾、3，5-二硝基水杨酸（DNS）显色液、硫酸、盐酸、硫酸铜、硫酸钾、木聚糖、-葡聚糖、亚硝基胍、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、蛋白胨、酵母膏、琼脂、葡萄糖等，均为化学纯试剂。
1.2 仪器与设备
1.2.1 仪器
烧杯、容量瓶、玻璃棒等实验室常用玻璃仪器。
1.2.2 设备
超净工作台、显微镜、恒温摇床、恒温培养箱、高温蒸汽灭菌锅、磁力搅拌器、电子天平、离心机、酸度计、分光光度计、酶标仪、恒温水浴锅、蒸馏水器。
1.3 实验方法
1.3.1 酶解湿基纤维皮去淀粉实验选择复配用纤维素酶
（1）酶制剂的应用条件
根据酶制剂应用原理，结合湿磨淀粉加工工艺，在不改变原工艺条件下使用酶制剂时，需要纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶等多种酶组分的协同配合。这些酶组分均需要符合如下条件：酶制剂最适使用温度为45～50 ℃;酶制剂最适使用在45～50 ℃、pH=3.5～4.5条件下有较好的稳定性;能够大规模工业生产，有较低的生产成本，适用于淀粉加工行业。
赛诺公司生产纤维素酶的菌株有1#、2#、3#，酶的适用温度范围为30～60 ℃，适用pH范围为3.0～6.0，其中耐酸性能1#>2#>3#，产酶性能2#>3#>1#。
（2）酶解湿基纤维皮去淀粉实验方法
取湿基纤维50 g，放入200 mL pH=4.0蒸馏水中（最好用乳酸调节，或者用亚硫酸调），在50 ℃水浴锅中加入纤维降解复合酶，按纤维皮湿重的0.1%添加，酶解30 min。酶解结束后，倒入80目的筛中过滤，滤液放入大于1 000 mL容器中，再用800 mL冷水冲洗筛上纤维，冲洗液和第二步的滤液合并一处。将合并后的滤液反复冲洗筛上纤维5次，取筛上纤维用纱布或绒布挤干水分，测水分、总淀粉含量、连接淀粉含量。空白不加酶对照也采用以上步骤。
（3）检测方法
纤维素酶（滤纸酶、CMC-Na酶）、木聚糖酶、β-葡聚糖酶及淀粉含量检测方法见参考文献[3-6]。
1.3.2 1#产纤维素酶菌株诱变育种实验方法
从产酶性能上进行对比，2#菌种产纤维素酶优于1#菌种，但1#菌种所产酶系耐酸性能好于2#菌种，生产及能耗低于2#菌种，生产成本低。因此，采用中粮营养健康研究院有限公司的ARTP（常压室温等离子体）诱变仪，并结合高通量筛选平台筛选高产纤维素酶突变菌株[7]的方法，对1#菌株进行诱变筛选，使其产纤维素酶性能与2#菌种相当。
（1）实验流程图
流程图如图1所示。
（2）孢子悬浮液的制备
将1#菌种接入菌种保藏斜面培养基，30 ℃培养86 h，活化2次，加入10 mL灭菌的生理盐水洗脱孢子，过滤菌丝，置于含有PDA液态培养基和玻璃珠的三角瓶中，充分打散。30 ℃，150 r/min培养使孢子萌发，吸取孢子悬液于离心管中，使孢子浓度调整到106～107 CFU/mL作为诱变原液。
（3）ARTP诱变方法
利用ARTP（常压室温等离子体）诱变仪对菌株进行诱变。诱变时的工作气体为高纯氦气。按照处理功率100 W，氦气流量12 SLM，样品与等离子体发生器出口距离2 mm，处理样品为10 μL，分别按照0、30、60、90、120、150、210、240、270、300 s不同照射时间来处理孢子悬浮液，考察致死率。
对处理后的孢子悬液进行稀释，取100 μL稀释液在含有羧甲基纤维素钠的筛选平板中进行涂板。每个照射时间做3个稀释梯度，每个稀释梯度做4个平行试验，置于30 ℃培养箱中培养。以0 min为空白对照，采用活菌计数法，确定致死曲线以及正突变率曲线。绘制致死曲线，在启动了修复功能的“马鞍型”曲线最低点确定下次诱变时间的参考值。根据变色圈大小和菌株生长速度，在平板上挑选单菌菌落点到初筛平板上。
（4）筛选方法
初筛：利用1#菌降解纤维素会在添加羧基纤维素钠的平板上产生透明圈的原理。将经过ARTP诱变仪诱变后筛选的菌落，转移到含有羧基纤维素钠的平板上，培养3 d，测定菌落周围透明圈直径（H）与菌落直径的大小（D），以H/D比值来衡量菌株产纤维素酶的能力大小[8]。挑选比值较大的菌落进行纯化并保存在斜面试管中。
二轮诱变：将初筛透明圈和菌落直径比值较大且生长性能好的菌株进行斜面培养后制备孢子悬浮液，应用ARTP诱变仪再次诱变。采用上述相同的方法进行羧基纤维素钠平板筛选，获得10 000株诱变后菌株。
纤维素酶活定量检测：采用12孔板对获得的10 000株诱变后菌株进行培养，培养基选用YPD，培养温度为30℃，转速为700 r/min，周期为90 h。离心取上清，应用高通量平台，采用国标NY/T 912-2004纤维素酶活测定方法，以羧甲基纤维素钠作为底物检测10 000株诱变后菌株产纤维素酶活性。筛选得到10株高产纤维素酶的突变菌株。
化学诱变：对ARTP诱变后获得高产纤维素酶的10株1#菌突变菌株再进行化学诱变。将10株1#突变菌株斜面培养于30 ℃，培养86 h，按照上述方法制备孢子悬浮液。取10 mL孢子悬浮液，加入10 mL亚硝基胍（NTG，4 mg/mL），30 ℃恒溫震荡处理5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 min后，适当稀释，涂布于含有羧甲基纤维素钠的筛选平板，30 ℃培养3～4 d，活菌计数，计算致死率，筛选高产纤维素酶1#诱变菌株500株。
此外，将10株1#突变菌株斜面培养于30 ℃，培养86 h，按照上述方法制备孢子悬浮液。取16 mL pH值7.0的磷酸缓冲液、4 mL孢子悬浮液、0.2 mL硫酸二乙酯（DES）原液充分混合（DES的终体积分数为1%），30 ℃恒温震荡处理5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 min后，分别于1 mL处理液中加入0.5 mL 25% Na2S2O3溶液终止反应。适当稀释后，涂布于含有羧甲基纤维素钠的筛选平板，30 ℃培养3～4 d，活菌计数，计算致死率，筛选高产纤维素酶1#诱变菌株500株。
使用与上文相同的纤维素酶活定量检测方法检测1 000株诱变后菌株的产纤维素酶活性，筛选得到4～5株高产纤维素酶的1#突变菌株。
（5）纤维素酶活高通量检测方法[9，10]
标准曲线制作：取一块96孔PCR板，第一列和第二列为平行实验组，第三列为对照组，在对照组加入40 μL 0.1 mol/L、pH=5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液，然后再加入50 μL DNS试剂，在实验组中分别加入20 μL浓度为0.1～0.7 mg/mL的葡萄糖标准溶液（由母液和乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制），然后加入20 μL去离子水和50 μL DNS试剂，将PCR板放入PCR仪中设置程序，95 ℃加热5 min，最后将其转入96孔酶标板中读取OD540数值，然后以葡萄糖浓度为Y轴，OD值为X轴绘制标准曲线（R平方大于0.99方可使用，每次新配制DNS试剂均需要绘制标准曲线）。
样品测定：取一块96孔PCR板，第一列、第二列、第三列为平行实验组，第四列为对照组，在平行实验组和对照组均加入20 μL样品，然后在对照组中加入50 μL DNS试剂，在实验组和对照组中都加入20 μL羧甲基纤维素钠溶液，将PCR板放入PCR仪中设置程序，37 ℃保温2 h，取出在实验组中加入50 μL DNS试剂，再次放入PCR仪中设置程序，95 ℃加热5 min，最后将其转入96孔酶标板中读取OD540数值，并将实验组数值取平均后减去对照组数值，代入标曲方程中，从而计算出酶活。
1.3.3 实验室模拟湿磨玉米淀粉加工确定复配酶复配方案的实验方法
（1）原料准备
称取100 g 玉米粒放入250 mL锥形瓶中，同样的样品做3个。然后配制600 mL SO2含量为0.145%的亚硫酸溶液，将玉米粒与酸溶液按1∶2混匀。
（2） 浸泡
将3份样品标号0、1、2，放入恒温水浴锅中进行浸泡，温度调节到50 ℃，并用温度计进行校对，浸泡时间45～50 h，对其进行间隔摇晃混匀。
（3）脱胚芽
将胚芽与胚乳使用手动进行剥离，然后用烘至恒重的铝盒将胚芽放入105 ℃烘箱进行烘干。约4 h，烘至绝干后称重。
（4） 研磨
将分离的胚乳放入研磨机中进行充分研磨，研磨至没有明显的颗粒物为止。
（5）酶解
用乳酸将研磨液pH调至4.0左右，称取酶加入到研磨液中，空白加入相应的蒸馏水，搅拌均匀，50 ℃下反应30 min后取出。
（6）纤维分离
先用50目的筛子进行过滤，滤上物进行研磨后，再次过滤。然后换成200目的筛子，将滤上物和50目的过滤液再次进行过滤，提取其中的纤维。将滤上物纤维置于烘至恒重的铝盒中于105 ℃烘箱中烘约4 h，烘至绝干后称重。采用高速粉碎机将其粉碎，然后检测干纤维中的总淀粉含量。
（7） 滤出液离心脱水
将滤出液平均置于三个离心瓶中，混匀后放入到高速旋转器中，10 000 r/min离心10 min，除去上清液。
（8）蛋白分离
向3个离心瓶中倒入65%自配浸出溶液，料水比为2∶1，混溶后放入到高速旋转器中，10 000 r/min离心10 min，然后分离上清液蛋白液。然后再溶解，再分离，共分离3次。将分离出的蛋白液放入离心瓶中中加水继续旋流，分离其中的上清溶液，沉淀蛋白置于烘至恒重铝盒使用105 ℃烘箱烘干（约4 h至绝干），称重。将其进行粉碎后测定粗蛋白含量。
（9） 可溶蛋白分离
与上步骤一样，只是将65%浸出溶液换为超纯水，料水比为2∶1。混溶后放入到高速旋转器中，10 000 r/min离心10 min，然后分离可溶蛋白。然后再溶解，再分离。共分离3次，水排放掉。淀粉加水溶解后放入器皿中自然沉淀，然后将上清液去掉，沉淀淀粉放入到烘箱中干燥（105 ℃，4 h），称重。干燥后放入磨中打碎，测定其粗蛋白含量。
（10）水分、总淀粉含量、粗蛋白含量检测方法
见参考文献[6，11，12]。
2 结果与讨论
2.1 酶解湿基纤维皮去淀粉实验选择复配用纤维素酶
经过多次反复酶解洗涤纤维皮实验，实验结果如表1。从实验数据分析，2#菌产纤维素酶对纤维洗涤效果最佳，其次为1#菌产纤维素酶，3#菌所产酶则几乎没有效果。
2.2 不同菌种来源纤维素酶组分分析
酶活分析结果显示，除了主链降解酶系外，2#菌所产纤维素酶中木聚糖侧链降解酶阿拉伯呋喃糖苷酶活力较高，可能对湿基纤维洗涤有重要影响（表2）。
2.2.1 纤维素酶生产菌株诱变育种实验结果 经过近半年的努力，以1#菌株为出发菌筛选出三支高產菌株，酶活基本与2#菌株酶活相近（表3）。
2.2.2 诱变菌所产纤维素酶的酶学性质
三支高产菌株中，诱变菌1所产纤维素酶的温度稳定性及pH稳定性良好（表4），符合湿磨淀粉加工的需求。
2.3 模拟湿磨玉米淀粉加工实验复配酶制剂结果
当使用诱变菌1#所产纤维素酶进行酶解，添加量为0.1%时，应用效果良好。但酶制剂用量偏大，使用成本较高，需要将添加量控制在在0.01%以内，才可以大量的应用于湿磨淀粉加工行业。因此，使用赛诺公司里氏木霉产200万U/g木聚糖酶和里氏木霉产1 500万U/g β-葡聚糖酶对其进行复配，可望再进一步提升使用效果，降低酶制剂使用成本。
2.3.1 不同用量纤维素酶添加实验
分别取100 g玉米进行实验室湿法加工工艺试验，将上述诱变菌1#所产纤维素酶按照0.006%、0.009%、0.012%的梯度添加量在针磨工艺环节后添加，进行后续模拟实验并进行理化分析，应用效果如图2。
由图2可知，随着纤维素酶用量的增加，淀粉、蛋白等收率逐渐增加，但考虑到湿法分离效果可提升性及此纤维素酶生产经济成本问题，采用0.006%添加量纤维素酶与木聚糖酶、β-葡聚糖酶进行进一步复合试验。
2.3.2 纤维素酶和木聚糖酶复配实验
将0.006%添加量的上述纤维素酶与0.001%、0.002%、0.003%三种梯度添加量的木聚糖酶进行复配，采用上述相同实验方法进行模拟实验和理化分析，应用效果如图3。
由图3可以看出，随着木聚糖酶添加量增加，淀粉收率增加缓慢，但蛋白收率等指标含量明显增加。为进一步提升综合分离效果，采用添加量为0.006%的纤维素酶、0.002%的木聚糖酶与β-葡聚糖酶进行后续复合试验。
2.3.3纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶复配实验
将0.006%的纤维素酶、0.002%木聚糖酶与0.001%、0.002%、0.003%梯度添加量的β-葡聚糖酶进行复配后，采用上述相同工艺实验进行模拟和理化分析，应用效果如图4。由图4可知，β葡聚糖添加量达到0.002%后，各生产指标变化幅度减缓，达到稳定有效分离效果。
2.4 复配酶作用效果验证
综合分析上述梯度添加量应用实验数据，以诱变菌1#所产滤纸酶活为200 U/g的纤维素酶、赛诺公司里氏木霉产200万U/g木聚糖酶和里氏木霉产1 500万U/g β-葡聚糖酶按3∶1∶1的比例进行复配后，与不添加酶的样品做对比实验，应用效果如表5。
通过模拟实验数据，复合酶可以降低纤维总淀粉含量3.4%，蛋白收率提高0.35%，淀粉收率提高1.98%，说明复合酶对提高湿磨加工玉米淀粉收率有良好效果。因实验室模拟实验，有局限性，需要进行生产实验，验证实验效果。
2.5 工厂放大验证
在中粮集团某日加工2 000 t玉米淀粉生产线上进行为期一个月的中试生产实验，试验结果如图5所示，验证了复合酶在提高淀粉和蛋白收率、减少能源动力消耗方面的效果。
3 结 论
本文以玉米结构组成与酶制剂作用原理为基础，从菌种诱变和高通量筛选出发，获得了适宜酶系的高表达菌株。进一步以此为基础进行酶系的复配，开发出一款可应用于玉米淀粉湿磨工艺的专用酶制剂。大生产实验数据表明，在无需添加较大生产装置和对生产工艺进行较大改动的情况下，仅在纤维洗涤槽添加0.01%用量的该复合酶时，可有效降低湿基纤维水分4.11%，湿基纤维总淀粉含量下降3.6%，淀粉收率提高0.21%，蛋白收率提高0.27%，显著提高了工艺的整体淀粉收率，并降低了能耗。
参考文献：
[1]曲音波. 木质纤维素降解酶系的基础和技术研究进展[J]. 山东大学学报（理学版），2011，46 （10）：160-170.
[2]方诩，秦玉琪，李雪芝，等. 纤维素酶与木质纤维素生物降解转化的研究进展[J]. 生物工程学报，2010，26（7）：864-869.
[3]QB 2583-2003，纤维素酶制剂[S].
[4]QB/T 4483-2013，木聚糖酶制剂[S].
[5]QB/T 4481-2013，β-葡聚糖酶制剂[S].
[6]GB/T 20378-2006，原淀粉 淀粉含量的测定 旋光法[S].
[7]杨海泉，马樱芳，宋江宁，陈坚，堵国成，沈微，陈献忠，樊游，刘龙. 一种结合常压室温等离子体诱变方式高通量筛选重组酶高产枯草芽孢杆菌宿主的方法：中国专利，CN104371994A[P]. 2015- 02-25.
[8]朱玉霞，张铁鹰，高爱琴，等. 高产纤维分解酶黑曲霉诱变选育与发酵条件优化[J]. 动物营养学报，2019，31（03）：1396-1404.
[9]聂简琪. 深孔板高通量细胞筛选技术的建立及在普鲁兰酶定向改造中的应用研究[D]. 无锡：江南大学硕士论文，2015.
[10]刘洋，唐芳荣，相宏宇，等. 小体系高通量比色测定糖化酶活力新方法[J]. 中国酿造，2012，31（07）：140-143.
[11]GB/T 5009.3-2016，食品安全國家标准 食品中水分的测定[S].
[12]GB/T 5009.5-2016，食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定[S].
相关热词搜索： 复合 加工 玉米淀粉 酶制剂
