石油烃降解菌CQ6产生物表面活性剂发酵条件的优化

发布时间: 2022-03-04 08:25:31 浏览：次

摘要：为了了解长庆油田石油烃降解菌产生物表面活性剂的情况，对菌株CQ6以原油为碳源时石油的降解率和发酵液表面张力进行了研究，并采用响应面分析法对该菌产生物表面活性剂的发酵条件进行了优化，在单因素的基础上，选择温度、转速和初始加油量3个因素，利用Box-Behnken中心组合原理和响应面分析法对数据进行了回归分析，得到了石油烃降解菌CQ6产生物表面活性剂的二次多项式回归方程的预测模型。结果表明，菌株CQ6产生物表面活性剂的最佳条件为温度25 ℃、转速190 r/min、接种量3.4%。在此条件下，菌株CQ6对石油的降解率可由优化前的64.4%升高至80.2%，菌株发酵液的表面张力由优化前的32.5 mN/m降至27.0 mN/m。

关键词：石油烃降解菌；生物表面活性剂；发酵；响应面分析；优化

中图分类号：TQ920.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）11-2710-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.040

Optimization of Conditions for Petroleum-degrading Bacteria CQ6

Producing Biosurfactant

FU Rui-min1，2，YANG Xue1，GU Ya-nan2，XUE Ting-ting2，XING Wen-hui1，ZHANG Hong1，ZHANG Li-qin1， CHANG Hui-ping1，CHEN Wu-ling2

（1.Department of Life Science，Henan Institute of Education，Zhengzhou 450046，China；

2.College of Life Science，Northwest University，Xi’an 710069，China）

Abstract： In order to determine the surfactant-producing situation of petroleum-degradation bacteria in Changqing oil field， degradation rate of petroleum and surface tension of fermentation broth were studied when stain CQ-6 used crude oil as the carbon source， and the fermentation condition was optimized. Based on the single factor experiment， the temperature， the rotate speed and initial amount of oil as factors， the prediction model of quadratic regression polynomial equation on surfactant-producing was simulated with Box-Benhnken central composite principle and response surface methodology. The result showed that，the optimum condition of biosurfactant producing by strain CQ6 was as follows： the temperature was 25 ℃，the rotate speed was 190 r/min and the initial amount of oil was 3.4%.Under this condition， the degradation rate of petroleum increased from 64.4% to 80.2% and the surface tension of fermentation broth decreased from 32.5 mN/m to 27.0 mN/m compared with before optimization.

Key words： petroleum-degrading bacteria； biosurfactant； fermentation； response surface analysis； optimization

石油开采过程中由于原油泄漏所造成的石油污染是当前重要的环境问题，土壤受到石油的污染会造成性质的改变，从而使植被及农作物难以生长[1]。针对石油污染土壤的修复，当前研究的热点集中于生物修复，即采用石油烃降解菌等微生物对石油的降解从而达到净化土壤的目的[2]。在石油烃降解菌降解石油的过程中，其限制步骤主要是石油污染物从土壤到细菌细胞内部的传递速率，而表面活性物质的参与可加速该传递过程[3]。

生物表面活性剂是某些微生物代谢产生的大分子物质，它们具有表面活性，既有亲水性，又有疏水性。与化学合成的表面活性剂相比，生物表面活性剂具有无毒、可生物降解、高效的乳化性和环境相容性等优点[4，5]，这些优点决定了生物表面活性剂在石油污染环境的生物修复中扮演重要角色。目前，针对生物表面活性剂产生菌的筛选、鉴定、代谢产物的分析及发酵条件的优化等方面已展开了部分研究[6-8]。但对石油烃降解菌产生物表面活性剂条件优化的相关报道却较少，且主要局限于采用单因素和正交试验的方法[9]。

响应面分析法是采用多项式来模拟多因子试验中各因素彼此间的相互关系，并在此基础上构建响应面，通过响应面的函数分析来研究因子相互之间的关系，并对相关数据进行优化设计，由于这种方法设计合理，优化结果较为优良，故当前被越来越多的生物、食品行业人员所采用[10]。本试验以从长庆油田分离得到的石油烃高效降解菌CQ6作为试验菌株，利用单因素试验考察了其发酵液表面张力和石油降解率，并在单因素试验的基础上，采用响应面分析法对菌株的发酵条件进行了优化，筛选出一组产生物表面活性剂的最适条件，以期为生物表面活性剂的开发和长庆油田石油土壤的原位修复奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株试验所用的石油烃高效降解菌菌株CQ6分离自长庆油田石油污染土壤，鉴定结果为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus），菌株由西北大学生命科学学院微生物实验室提供，试验用油采自长庆油田第三采油厂。

1.1.2 试剂、培养基与仪器 ①试剂：石油醚、无水硫酸钠、硫酸，均为分析纯。②培养基：LB培养基、无机盐培养基。③仪器：WZY-1自动液体表面张力仪，上海衡平制造厂；759S紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司。

1.2 试验设计

1.2.1 单因素试验试验考察了不同温度、pH、转速和初始加油量对石油烃降解菌菌株CQ6产生物表面活性剂的影响。

1.2.2 响应面分析法优化试验以单因素试验结果为依据，根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，以温度（A）、转速（B）和初始加油量（C）作为自变量，发酵液表面张力（Y）为响应值，做3因素3水平的响应面分析优化试验，试验因素与水平如表1所示。

1.3 测定指标及方法

试验菌株所产表面活性剂性能测定采用表面张力检测法[11]，使用张力仪检测发酵液的表面张力。试验菌株对原油的降解率测定采用紫外分光光度法[12]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 温度对菌株CQ6产生物表面活性剂的影响温度可影响微生物的生长与繁殖速率，在初始加油量4%，培养基pH 7.0时，试验将培养基分别置于15、20、25、30、35、40 ℃下，在转速为200 r/min的摇床中发酵培养24 h，分别测定各发酵液的表面张力，结果如图1所示。由图1可知，当温度低于20 ℃和高于40 ℃时，发酵液的表面张力均较大，表明菌体代谢产生物表面活性剂的能力均较弱，而在温度为25～35 ℃时，菌体可很好地生长并代谢产生表面活性剂，基于此结果，将25～35 ℃作为菌体产生物表面活性剂的最适温度范围。

2.1.2 pH对菌株CQ6产生物表面活性剂的影响 pH可通过影响细胞膜的通透性、细胞膜结构的稳定性和物质的溶解性来影响营养物质的吸收，从而影响菌体生长，进而影响生物表面活性剂的产量。在初始加油量4%时，将培养基的pH分别设置为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，于30 ℃、转速为200 r/min的摇床中培养24 h，测定各发酵液的表面张力，结果如图2所示。由图2可知，菌株CQ6在pH为6.5～7.5时长势较好，所产生物表面活性剂较多，菌株发酵液的表面张力较低，且彼此间无较大差异，但当pH低于6.5或高于7.5时，发酵液的表面张力明显增加，表明此时菌株CQ6产生物表面活性剂的能力明显下降，菌株的生长受到抑制，基于此结果，将pH（6.5～7.5）选为菌株CQ6产生物表面活性剂的最适pH范围。

2.1.3 轉速对菌株CQ6产生物表面活性剂的影响摇床的转速决定了菌株发酵液中的氧溶解量，由于石油烃降解菌降解石油通常是有氧代谢，故氧是石油烃降解菌CQ6降解石油过程中不可或缺的重要因素，转速的大小直接决定了菌株数量的多少，进而影响生物表面活性剂的产量。将摇床转速分别设置为140、160、180、200、220、240、260 r/min，于30 ℃、初始加油量4%、pH 7.0的条件下分别培养24 h，测定各发酵液的表面张力，结果如图3所示。由图3可知，菌株CQ6在转速为180～220 r/min时长势较好，产生物表面活性剂较多，表现为菌株发酵液的表面张力较低，当摇床转速低于160 r/min和高于240 r/min时，发酵液的表面张力均有明显提升，表明此时菌株活性降低，产生物表面活性剂的能力也下降。推测其原因一方面是转速过低导致氧溶解量不足，从而引起菌体代谢减缓，产生物表面活性剂能力下降；另一方面是转速过高导致过量的氧溶解，引起菌体将所产的生物表面活性剂也作为碳源消耗掉，最终导致生物表面活性剂产量下降。基于此，将180～220 r/min设置为产生物表面活性剂的最适转速范围。

2.1.4 初始加油量对菌株产生物表面活性剂的影响试验中所加入的原油是菌株CQ6惟一的碳源，因此初始加油量的多少直接影响菌体的生长状况，进而影响菌株生物表面活性剂的产量。本研究将初始加油量分别设置为1%、2%、3%、4%、5%、6%，设置摇床转速为200 r/min，于30 ℃、pH 7.0的条件下分别培养24 h，测定各发酵液的表面张力，结果如图4所示。由图4可知，当初始加油量低于3%时，发酵液的表面张力较高，说明菌体生长状态不好，所产的生物表面活性剂不多，再次证明了充足的碳源会促进菌体生长并产生生物表面活性剂；初始加油量在3%～5%时，发酵液表面张力明显下降，说明菌体在大量生长并产生生物表面活性剂，然而当初始加油量高于5%时，发酵液的表面张力有大幅度提升，推测可能的原因是初始加油量过多会导致油层覆盖于培养基表面，初始加油量越大，则石油烃降解菌CQ6所能获得的氧气就越少，氧气的缺乏可抑制菌株的正常生长，从而导致由菌株代谢所产的生物表面活性剂的产量也有所降低，进而菌株发酵液表面张力就会升高。基于以上结果，将初始加油量设置为3%～5%作为产生物表面活性剂的最适加油量范围。

2.2 响应面分析法优化试验结果

2.2.1 响应面分析法方案及结果以温度（A）、转速（B）、初始加油量（C）为变量，以菌株发酵液的表面张力（Y）为响应值进行响应面分析法优化试验，试验方案及结果见表2。

2.2.2 多元二次响应面回归模型的建立与分析采用软件Expert 8.0对表2中的结果进行二次回归分析，构建出多元二次方程：

Y=29.57+0.50A-0.42B-0.09C+0.60AB-1.20AC+0.58BC-0.65A2-0.77B2-0.32C2+1.32A2B，各个因素的方差分析结果如表3所示。由表3可以看出，模型的P为0.020 5，小于0.05，说明回归模型显著，失拟项P为0.930 5，说明模型可靠，用该模型对石油降解菌CQ6产生物表面活性剂的发酵工艺进行预测和分析，结果准确。

根据回归方程，获得温度、转速和初始加油量彼此间两两交互对菌株发酵液表面张力的影响，图5、图6和图7为相应的响应面曲线图。由图5、图6、图7可知，温度、转速和初始加油量彼此间两两交互对发酵液表面张力的响应值均存在最小值，经过响应面分析，3个影响菌体发酵液表面张力的关键因素温度、转速、初始加油量的最优试验点分别是25 ℃、190.40 r/min、3.41%，在此条件下，预测其表面张力为26.893 7 mN/m。

2.2.3 发酵条件优化验证为了便于操作，将发酵的最优条件适度调整为温度25 ℃、转速190 r/min、初始加油量3.4%。经检测，在优化前，菌株CQ6在摇床转速为200 r/min，温度为30 ℃，初始加油量为4%的条件下，对石油烃的降解率为64.4%，菌株发酵液的表面张力为32.5 mN/m；优化后，在温度为25 ℃，摇床转速为190 r/min，初始加油量为3.4%时，发酵液的表面张力降低至27.0 mN/m，较优化之前降低了16.9%，对石油烃的降解率提高至80.2%，较优化之前提高了15.8个百分点。

3 结论

本试验对长庆油田高效石油烃降解菌CQ6进行了石油降解率和发酵液表面张力的研究，并采用Box-Benhnken和响应面分析法对该菌产表面活性剂的条件进行了优化，得出在温度为25 ℃，摇床转速为190.40 r/min，初始加油量为3.41%时，菌株发酵液表面张力预测值为26.893 7 mN/m。为检验该设计的可靠性，采用上述预测条件进行发酵，为了便于操作，将发酵的最优条件适度调整为温度25 ℃、转速190 r/min、初始加油量3.4%，在此条件下，测得菌株发酵液的实际表面张力为27.0 mN/m，接近理论预测值。由此可得，采用响应面分析法优化菌株CQ6产生物表面活性剂的发酵工艺，所得最佳条件可靠，具有实际应用价值。

目前对石油烃降解菌的研究主要集中于石油烃降解菌的筛选及降解性能的测定[13-15]，但有关石油烃降解菌所产生物表面活性剂的发酵条件优化的研究却相对较少，且主要集中于单因素试验和正交试验。但上述方法存在下列缺陷：单因素试验不考虑因素间的交互作用，正交分析又无法找出各个因素的最佳组合[16，17]。采用响应面分析法可克服上述存在的缺点。本试验采用响应面分析法优化石油烃降解菌CQ6产生物表面活性剂的发酵工艺，此发酵工艺可使发酵液的表面张力比优化之前降低16.9%，对石油烃的降解率比优化之前提高15.8个百分点。

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