焦化废水中降解酚优势菌分离鉴定

���h�j{[i�^�&�z��jب��݉ק�'�q�b�駝4��ׯ� `h�!����v�a欶��r,���bΆ�h��Yn��Czx��'�xi�kz&��ƥ���뭮�a��޲�h�����@q�\���'.���]��o!�m4��׽4������&�v��ۭθ����ʹ��4���c��m4�h?/^a�}z�O�V���"http://www.hbzzbh.com/k/cailiao/" target="_blank" class="keylink">材料与方法

1.1菌源

取自中煤龙华哈尔滨煤化工有限公司废水处理系统的活性污泥。

1.2培养基

无机培养基：MgSO4·H2O 0.2 g、FeSO4·H2O 0.1 g、MnSO4·H2O 0.1 g、CaCl2 0.2 g、K2HPO4 0.5 g、KH2PO4 0.5 g、（NH4）2SO4 0.45 g、NaCl 0.1 g、葡萄糖2 g、水1 000 ml；

有机培养基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂20 g、水1 000 ml、调节pH 7±1（若制备固体培养基则加入琼脂20 g）；

筛选培养基：MgSO4·H2O 0.2 g、FeSO4·H2O 0.1 g、MnSO4·H2O 0.1 g、CaCl2 0.2 g、K2HPO4 0.5 g、KH2PO4 0.5 g、（NH4）2SO4 0.45 g、NaCl 0.1 g、酚、调节pH 7±1。

1.3试验仪器

电热恒温培养箱，CHAS气浴恒温振荡器，YXQ·SG46·280SA手提式压力蒸汽灭菌器，精密电子天平，CJ1D洁净工作台，PHS3C精密pH计，721分光光度计。

1.4灭菌条件

①高压蒸汽灭菌：小件玻璃器皿、培养基等采用湿式高压蒸汽灭菌。这种灭菌方式可以达到彻底的灭菌。灭菌条件：0.103 MPa，121 ℃，20 min。

②紫外灭菌无菌操作台：采用紫外灭菌方式，用紫外灯灭菌30 min。该种方式对空气进行灭菌，操作简单方便，效果不错。

1.5酚降解菌株的筛选

目前，所进行试验研究的大部分优势降酚菌种主要以单一一种酚为基质进行筛选，而在实际应用中单一酚的情况比较少，取而代之的则是混合酚的基质条件，这样致使所获得菌种在实际应用中对混合酚耐受力差，适应其环境缓慢，降解率不能得到快速提高，在实际应用中效果大打折扣，远不如在试验小试时得到的去除率效果明显。在以实际工程为依据的基础上，该试验将苯酚、甲基酚、二甲基苯酚、苯二酚按照30∶10∶10∶25的比例来配制筛选培养基，得到了一株能够适应高酚及混合酚条件的菌株。筛选过程如下：

取中煤龙华哈尔滨煤化工有限公司废水处理系统的污泥废水混合物，此时的废水水质：COD 1 180 mg/L、酚浓度855 mg/L、氨氮浓度45.88 mg/L、pH 7±1、温度35～40 ℃，取此废水1 000 ml并在35 ℃的条件下曝气48 h。将曝气48 h后的泥水混合物沉降30 min，取上层澄清后的菌悬液100 ml，按照筛选培养基的比例投加药剂，搅拌均匀，在气浴恒温振荡器中以30 ℃、150 r/min的速度恒温振荡24 h。24 h后取振荡的菌悬液10 ml投加到浓度为200 mg/L的筛选培养基中继续在30 ℃、150 r/min的条件下恒温振荡培养24 h。重复上一步操作，每次增加筛选培养基中酚浓度200 mg/L，直至达到1 000 mg/L。取经过1 000 mg/L高酚浓度筛选后的菌悬液，利用有机固体培养基进行平板划线分离纯化培养直至获得单个菌落。将所获得的单个菌落进行有机富集培养。

1.6酚降解菌株的分子鉴定

微生物分子生态学与传统的以纯培养为基础的技术相比较，最明显的一个优势在于微生物分子生态学是利用分子生物学的方法，直接提取环境样品中的总DNA，然后在分子的水平上对其微生物区系进行解析。随着16S rDNA方法的发展，它逐渐被应用于对环境样品的微生物进行鉴定和分类[11-13]，但是环境样品和纯培养样品相比成分更加复杂，提取DNA和杂交等试验的要求条件更加苛刻。而与16S rDNA比较，16S rRNA基因序列为1 550 bp左右，由保守区和可变区组成，通常编码酶的基因不像16S rRNA基因这样具有不可替代的作用，因此 16S rRNA基因在进化上相对保守，并且由于16S rRNA基因在细菌中是普遍存在的，所以可以通过对比其序列的相似性来鉴定它们之间的亲缘关系[14]。目前，16S rRNA基因序列和功能基因序列被广泛地用来进行微生物多样性的研究，该技术已发展成为纯培养微生物以及环境微生物分类和鉴定的一个有力工具。对于纯化培养后降解酚优势菌，用PCR方法扩增分离菌株的16S rRNA基因，插入pUCm-T载体（上海生工公司），转化E.coli DH5α送某公司测序，所得序列与GenBank的16S rRNA基因序列进行blast比对，初步确定其属名。所用PCR引物：

27F，5′AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3′；1492R，5′CGGYTACCTTGTTACGACTT3′[15]。PCR反应条件见文献[16]。经测序确定其属名后知，筛选出来的降解酚优势菌株为Stenotrophomonas maltophilia K279，在下文中简写为S.maltophilia K279。

2试验结果

2.1菌落特征

取S.maltophilia K279的菌悬液，并将其制备成10-6、10-7稀释度的菌悬液，配制有机固体培养基，用无菌玻璃涂棒在固体培养基上均匀地涂布，室温下静置5 min后，在恒温培养箱中培养24 h。如图1所示，即为24 h后所生长的S.maltophilia K279的菌落特征。

从图1可知，S.maltophilia K279菌落呈淡黄色，单个菌落呈近似圆形，有些许光泽，质地粘稠，菌落略突出于培养基表面且表面湿润易于挑起接种。由图1b可知，菌落边缘较为平整光滑，个别有略微小锯齿状。

2.2菌株特征

微生物细胞的形状、大小、鞭毛、荚膜等都是微生物形态的重要特征，由于菌体很小，只能在显微镜下进行观察测定。

取固体纯培养3 d的S.maltophilia K279，用接种环挑取少许菌落至于载玻片（载玻片用前需浸泡1 d，以减少对显微镜观察的干扰）上，并滴少量灭菌蒸馏水使载玻片上的菌落得到充分稀释，待水分蒸发后，用原子力显微镜对其进行观察测定。

如图2所示，从所拍下的单个细菌细胞的图片可以清楚地观察到，S.maltophilia K279为短杆菌，形状呈椭圆状，无鞭毛无荚膜。原子力显微镜拍摄后的图片可以在Nanoscope 5.30r3sr3软件上进行大小的测定。图3即是在Nanoscope 5.30r3sr3软件上进行相关测定后所拍下的单个细菌的长宽图片，由软件测得S.maltophilia K279长为66.591 nm；宽为59.963 nm。

2.3菌株生长曲线

配制50 ml有机培养基，向其中加入S.maltophilia K279菌悬液10 ml，在气浴恒温振荡器中以30 ℃、150 r/min的条件恒温振荡培养。每隔2 h测定一次其吸光度，连续测定24 h。图4为连续测定24 h后所作出的S.maltophilia K279生长曲线图。

如图4所示，曲线走势为较光滑上升式曲线，说明S.maltophilia K279的生长整体呈上升趋势，随着时间的增加其生长速度也随之加快。生长曲线可分为3个阶段，第一阶段是0～4 h，此时为缓慢生长阶段，吸光度值仅从7.00增加到12.90。第二阶段是快速生长阶段，在生长到6 h时吸光度值已经达到了1.20×20（×20表示菌液稀释了20倍，下同），近似于2 h测定时的3倍，4 h测定时的两倍。因此，从此时开始细菌进入快速生长阶段。第三阶段即为稳定生长阶段，在S.maltophilia K279生长16 h时，吸光度值为3.85×20，细菌的生长开始进入稳定高峰期，随后细菌生长达到了一个稳定的过程，吸光度值介于3.85×20～4.05×20之间，有较小的波动，保持着高效稳定的生长势头。由此说明，S.maltophilia K279在培养生长16 h以后，将进入一个相对稳定的生长阶段。

3结论

以中煤龙华哈尔滨煤化工有限公司废水处理系统的活性污泥为试验用污泥。通过从中煤龙华哈尔滨煤化工有限公司废水处理系统中取得的污泥废水混合物中提取菌悬液，并经过含高浓度酚的培养液进行优势菌的筛选培养，通过平板纯化手段分离出单一菌株，对分离出的纯菌株进行驯化、富集培养。所培养出的降酚优势菌经过PCR扩增分离菌株的16S rRNA基因序列来进行其分子鉴定，鉴定结果确定此优势菌的属名为Stenotrophomonas maltophilia K279。对优势菌S.maltophilia K279进行其相关性质的测定，通过固体培养观察其基本的菌落特征，菌落略突出于培养基表面且表面湿润易于挑起接种，颜色呈淡黄色，近似圆形且菌落边缘较平整光滑，个别有微锯齿状出现，菌落有些许光泽并且质地粘稠。在原子力显微镜下拍摄单个细菌的图片中，显示出S.maltophilia K279是短杆、呈椭圆形状、无鞭毛、无荚膜的细菌。利用Nanoscope 5.30r3sr3软件计算S.maltophilia K279单个细菌的大小，得出细菌长为66.591 nm；宽为59.963 nm。在对此优势细菌的24 h生长培养中，生长曲线整体呈上升趋势，大致分为缓慢生长、快速生长和稳定生长3个阶段，当经过16 h的生长培养后，细菌生长便进入其高峰期，并且生长稳定，达到稳定的生长阶段。

安徽农业科学2015年

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