摘要：在稳定的ISSR-PCR扩增条件下，使用50个大麻ISSR引物对代表性的大麻材料进行PCR扩增，筛选出14个适合大麻的ISSR引物；同时，为优化大麻染色体的制片质量，对大麻染色体制片过程中的变温预处理、低温提高中期分裂相的方法及解离等具体技术与方法进行了试验，优化后的大麻染色体制片条件为：芽长达1 cm后（21 ℃），23 ℃ 条件下促芽生长24 h，再低温（0 ℃）处理24 h，37 ℃解离20 min（20 g/L纤维素酶和20 g/L果胶酶）。适合大麻ISSR-PCR反应的引物筛选与染色体制片技术的优化，将为大麻遗传多样性的多层次化分析提供试验基础。
关键词：ISSR引物；大麻；染色体；制片技术
中图分类号： S563.303 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0030-03
收稿日期：2013-08-13
基金项目：黑龙江省自然科学基金（编号：QC2012C115）；黑龙江省哈尔滨市青年科技创新人才项目（编号：2013RFQYJ014）。
作者简介：张利国（1978—），男，黑龙江哈尔滨人，博士研究生，助理研究员，从事麻类分子育种学研究。E-mail：zlg86@aliyun.com。
通信作者：张效霏。E-mail：14975487@qq.com。大麻起源于我国，大麻纤维公元前8世纪即有应用，是人类历史上最早应用的纤维作物[1]，目前在纺织、建筑和医药上都有广泛用途。国内主要是应用大麻纤维，大麻纤维具有吸湿、透气、杀菌抑菌、无静电等特点，且具有极强的抗紫外线功能，已成为重要的军用纺织品原料。由于大麻是雌雄异株作物，遗传资源极容易混杂，而且至今未能建立起有效的鉴别方法和标准[2]，给大麻的种质鉴定、扩大栽培等带来不便。
ISSR可以在没有任何分子生物学研究基础的情况下，进行基因组指纹图谱的构建。ISSR引物较长，因而对PCR反应的敏感性低于RAPD，稳定胜优于RAPD，具有较好的稳定性和多态性[3-5]。针对目前大麻遗传学研究基础薄弱、相关的SSR引物并未开发的现状，ISSR标记技术是从分子水平研究大麻遗传分化较合适的方法。ISSR标记可重复性明显优于RAPD，但不如细胞学标记直观和稳定，而细胞学的核型资料在种内相当稳定，直观性好，说服力强，同时在研究植物的起源与进化上具有独特的优势[6]。综合利用细胞遗传学和 ISSR 技术来研究大麻遗传多样性，将有效地克服单一方法存在的局限，从各自的角度提供种间分化信息。
对于不同植物，其染色体压片技术中的处理手段与处理时间各不相同。目前传统的大麻制片方法是通过对二氯苯、8-羟基喹啉、秋水仙碱[7]等化学药剂的作用，使染色体分裂相尽可能地停留在中期，但由于使用了化学药剂，容易产生染色体的异常分裂、染色体断片、丢失、形态上的扭曲等现象，不利于荧光原位杂交等后续试验。同时，如果操作不当，易诱发人的细胞染色体突变，对长期制片工作者具有一定的损害。此外，这些方法在操作上效果有限，获得大量中期分裂相难度较大，给大麻染色体分析带来直接困难。
本研究在建立大麻ISSR-PCR反应体系的条件下，筛选出适合大麻的ISSR引物；同时采用日本京都大学细胞遗传学家远藤教授的植物染色体制片方法（该方法在小麦、亚麻、苎麻等作物上都取得了良好效果），结合大麻作物特点，优化大麻染色体制片条件。研究结果将为从细胞和分子水平综合分析大麻遗传起源、进化提供研究基础，两方面互相补充，将会有效克服单一方法存在的局限。
1材料与方法
1.1供试材料
供试材料黑龙江大麻地方品种Wuchang40以及代表性大麻资源K-16、K-20由黑龙江省农业科学院经济作物研究所提供。ISSR分析采用哥伦比亚大学最新公布的50条引物。
1.2试验方法
1.2.1筛选适合大麻的ISSR引物在前期工作中，反应体系各因素及梯度设计见表1。
3.2细胞学制片优化
制片的关键在于根尖材料的处理。本试验通过变温处理来提高根尖细胞的分裂指数，在21 ℃萌发后转到8 ℃条件下培养40 h，再转到23 ℃下培养24 h。不同大麻品种变温处理具体要求可能会稍有变化，可随时压片镜检确定，原则上也就是在根尖生长最旺盛的时候取材。
冰水混合物（低温冷处理）的作用是通过抑制微管蛋白组装成纺锤丝，因此凡进入中期的染色体均被阻遏而不进入分裂后期，这样就可以累积大量的处于分裂中期的染色体。
本试验采用24 h低温处理，染色体长度适中，形态良好。在处理的过程中一定保证冰水混合物的状态；并且处理时间不能过长，否则会导致染色体高度浓缩，不利于进一步分析。低温处理的方法简便易行，获得的中期分裂相较多，效果良好，而且由于在整个制片过程中没有使用化学药剂，所以不会出现污染和因为前处理产生异常分裂现象，可为原位杂交等后续技术在大麻研究上的应用奠定试验基础。
大麻ISSR引物的筛选和高质量细胞学制片技术的优化，将为多层次、多角度研究大麻遗传信息奠定基础，包括研究大麻遗传多样性、物种起源和遗传演化等。
参考文献：
[1]关凤芝. 大麻遗传育种与栽培技术[M]. 哈尔滨：黑龙江人民出版社，2010.
[2]张利国，关凤芝，吴广文，等. 基于核型与RAPD标记的大麻地方品种遗传多样性分析[J]. 中国麻业科学，2009，31（3）：169-172，181.
[3]陶爱芬，祁建民，粟建光，等. SRAP和ISSR及两种方法结合在分析黄麻属起源与演化上的比较[J]. 作物学报，2011，37（12）：2277-2284.
[4]汪斌，祁伟，兰涛，等. 应用ISSR分子标记绘制红麻种质资源DNA指纹图谱[J]. 作物学报，2011，37（6）：1116-1123.
[5]张明，李延龙. 基于ISSR标记的韭菜种质资源遗传多样性初探[J]. 西北农业学报，2012，21（1）：146-150.
[6]Sheng Y，Zheng W H，Pei K Q，et al. Population genetic structure of a dominant desert tree，Haloxylon ammodendron（Chenopodiaceae）in the Southeast Gurbantunggut desert detected by RAPD and ISSR markers[J]. Acta Botanica Sinica，2004，46（6）：675-681.
[7]辛培尧.大麻染色体行为分析[J]. 西北植物学报，2008，28（11）：2189-2193.
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