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| 53@ ^]4 M#GiMm3@!4*!ƶ ۞:3@!4M*4K_V"http://www.hbzzbh.com/k/cailiao/" target="_blank" class="keylink">材料与方法
1.1甘薯小象甲
甘薯小象甲采自云南省元谋县，在实验室内采用甘薯块根饲养多代，饲养条件如下：温度为（28±0.5）℃，相对湿度为75%±5%，光周期为L∥D=0 h∥24 h。分别取雌雄成虫各3头用于测序及系统发育分析。
1.2基因组DNA的提取
1.2.1Chelex100法提取
取甘薯小象甲成虫除去鞘翅，用灭菌ddH2O清洗干净后在灭菌滤纸上干燥，干燥后取单头甘薯小象甲置于1.5 mL的离心管中，用灭菌玻璃棒充分研磨，加入150 μL悬浮好的5% Chelex100溶液，100℃金属浴5 min，漩涡溶液5 s，12 000 r/min 离心5 min，上清液即可作为PCR反应的DNA模板。
1.2.2试剂盒提取
取甘薯小象甲成虫用ddH2O清洗干净后在滤纸上干燥，按基因组DNA提取试剂盒（北京全式金生物技术有限公司生产）说明提取DNA。
1.3试验处理
1.3.1Chelex100法提取和试剂盒提取对比
分别采用Chelex100法和试剂盒法提取单头甘薯小象甲，各重复3次。
1.3.2不同保存方式标本提取对比
分别以新鲜活虫、干制标本以及75%乙醇保存的甘薯小象甲为材料用Chelex100法提取DNA，各重复3次。
1.3.3模板保存时间的探索
将单头提取的甘薯小象甲DNA模板保存在-20℃冰箱中，分别对保存0、30、60、90 d的模板进行PCR扩增。
1.4ITS1区PCR扩增
ITS1区PCR扩增引物：正向 5′TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT3′；反向 5′ACG AGC CGA GTG ATC CAC CG3′[8]，引物由上海生工生物工程有限公司合成。扩增反应在30 μL反应体系中进行：11 μL ddH2O，15 μL 2×Taq PCR StarMix，正反引物各1.5 μL，DNA模板1 μL。扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性60 s，55℃退火90 s，72℃延伸90 s，循环35次；最后72℃延伸10 min，置于4℃冰箱保存。
取2 μL PCR扩增产物和3 μL核酸染料混合，于1.2%的琼脂糖凝胶上电泳检测，电泳缓冲液为0.5×TBE，在120 V电压下进行45 min，置于UPV紫外成像系统上观察成像，并拍照。目的条带的纯化、测序和序列正反拼接均由华大基因完成。
1.5数据分析
将测得的6个甘薯小象甲ITS1序列在NCBI上进行比对，选取GenBank中同源性较高的甘薯小象甲以及中国6个地区甘薯小象甲的ITS1序列（表1），采用MEGA 6.06进行同源性比较，以稻水象甲序列为外群，用NJ法构建系统发育树，遗传距离采用pdistance法，空位成对删除，用自展法对构建的系统发育树进行内部分支检验，重复1 000次。
2结果与分析
2.1Chelex100法提取与试剂盒提取对比
电泳检测结果显示（图1：泳道编号1～6）：试剂盒提取单头甘薯小象甲DNA经ITS1 PCR扩增，电泳条带较暗，其中一个重复没有条带，而Chelex100法则均获得清晰明亮的电泳条带，表明试剂盒提取单头甘薯小象甲基因DNA的效果没有Chelex100法理想，甚至有可能存在失败的情况，而Chelex100法可抽提到适于PCR扩增反应的DNA模板，可为后续PCR试验提供足量的模板。
2.2不同保存条件标本Chelex100法抽提效果对比
结果表明（图1：泳道编号7～9）3种保存方式保存的样品采用Chelex100法均能抽提到有效的DNA模板，但是電泳条带亮度显示：新鲜活虫>干制标本>75%乙醇保存标本。
2.3模板保存时间对PCR效果的影响
Chelex100使用说明上指出该法所获得模板应当于1周内使用，保存时间较短。而本试验结果显示（图1：泳道编号10～13）：置于-20℃下保存1～3个月后的模板经PCR扩增，仍能获得较为清晰的电泳条带，但是电泳条带的亮度变暗，表明Chelex100法提取的单头甘薯小象甲DNA模板在-20℃下可以保存较长的时间。
2.4甘薯小象甲rDNA ITS1系统发育分析
由于有些地区的甘薯小象甲序列相似度较高，差异不明显，因此系统发育树的部分分支自展值偏低，但是3个地域性分支的自展值都在90以上（图2）。
该树表明甘薯小象甲被分为东亚分支和印度分支两大主支，东亚分支又分为东北亚亚支和东南亚亚支，其中东北亚亚支包括日本各地区，中国台湾、浙江、广东、福建和重庆地区，越南河内，美国佐治亚州、夏威夷岛以及圣基茨和尼维斯的圣基茨岛；东南亚亚支包括越南胡志明市，菲律宾吕宋岛，印度尼西亚苏门答腊岛，泰国以及中国云南地区，其中云南地区3个甘薯小象甲序列长度和泰国一致，且雌雄成虫的ITS1序列长度并无明显差异，同源性达到100%。
3结论
与传统酚/氯仿抽提法相比，Chelex100法未使用苯酚去除蛋白，因此DNA纯度不高，但PCR对模板纯度的要求较低，Chelex100法获得的DNA足以扩增出所需的基因片段，因此结果是可靠的[26]。本试验首次利用Chelex100法快速提取甘薯小象甲DNA，与试剂盒法需裂解3 h相比较，Chelex100法提取的整个过程只需15 min左右，使其ITS基因的PCR扩增更加简便、省时，克服了利用传统形态学鉴定的困难，在快速鉴定甘薯小象甲以及大规模提取其基因组DNA等方面具有重要意义。但是PCRRFLP等精细分子试验以及其他昆虫的基因组DNA的提取能否采用Chelex100法还有待进一步的研究。
甘薯小象甲起源于印度[27]，由于其飞行能力差[28]，主要通过人为运输带虫甘薯传播[27]。经与国内外的甘薯小象甲序列进行比较分析，研究结果与Kiyohisa等[24]的研究结果基本一致，甘薯小象甲可以分成两个明显的地域性主支，即印度分支和东亚分支，东亚分支又分为东北亚亚支和东南亚亚支。此外，印度分支和东亚分支的序列长度差异较大，东亚分支的甘薯小象甲ITS1序列长度范围在557～574 bp，明显短于印度地区的甘薯小象甲。其中云南地区的3个甘薯小象甲ITS1序列长度和泰国地区的一致，且位于东南亚亚支的同一分支上，由此说明云南地区3个甘薯小象甲很有可能是由泰国传入的。与于海滨等[25]的报道不同，他们的研究表明中国甘薯小象甲至少有两个来源，但都处于东北亚亚支上。本研究首次发现中国云南地区的甘薯小象甲处于东南亚亚支上，也就是说，云南元谋县的甘薯小象甲种群来源与中国广东、福建、浙江和重庆的不同。至于云南的甘薯小象甲是否还存在其他的遗传变异，还有待更多地区的标本进行分析。
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（责任编辑：杨明丽）
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