zjvȬm vǪz TH(VzhmZXVzȧ"| ~!jj{=aȭy^vZ6Z8jaz j,y֧v+yr'r'wi)찢l+jzޖ-a:r zii}t?huj&k)yȞ&Wׄ,秱jj{N)jfdz{b~y9b(ijȧM&dڶzqޞǓzwh ˦Nw)ƥy:ru^Nj(){"x*'}-D_V"http://www.hbzzbh.com/k/cailiao/" target="_blank" class="keylink">材料与方法
1.1 材料
玉米籽粒霉烂样本：高唐县11份、东昌府区11份、冠县5份、茌平县10份、阳谷县17份。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉20 g、蒸馏水1 L。
试剂：2×Es Taq Master Mix，北京康为世纪生物科技有限公司;真菌基因组DNA提取试剂盒，北京艾德莱生物科技有限公司;DL2000 DNA Marker，TaKaRa公司;50×TAE，上海生工生物工程有限公司;Biowest Agarose G10，南京生兴生物技术有限公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成。
仪器：PCR仪，东胜龙ETC811;GelDoc XR+凝胶成像分析系统，美国BioRad公司;DYY11型电泳仪，北京六一仪器厂;Neofuge 15R台式高速冷冻离心机，上海力申科学仪器有限公司;HWS12型电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司。
1.2 病原菌分离鉴定
取发病籽粒置于2.0%的次氯酸钠溶液中浸泡5 min，再以无菌水冲洗3遍，用灭菌滤纸吸干籽粒表面水分后将其放置在PDA平板上，于27℃黑暗条件下培养3～5 d，待长出菌丝后进行分离纯化获得单孢菌株，在新的PDA平板上27℃黑暗培养3～5 d后，参照《真菌鉴定手册》[6]和《中国真菌志青霉属及其相关有性型属》[7]，根据菌落形态和分生孢子的大小及形态特征等对菌株进行初步的形态学鉴定。
将培养好的真菌用真菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，用真菌特异性引物ITS1/ITS4（ITS1：5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′;ITS4：5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）[8]和镰孢菌延伸因子引物EF1/EF2（EF1：5′ATGGGTAAGGARGACAAGAC3′;EF2：5′GGARGTACCAGTSATCATGTT3′）[9]进行分子生物学鉴定。PCR反应体系为：模板DNA 1.0 μL，10 μmol/L上游引物和下游引物各0.5 μL，2×Es Taq Master Mix 12.5 μL，加ddH2O补足至25.0 μL。PCR反应程序为：95℃预变性10 min;95℃变性1 min，退火温度下退火30 s（ITS1/ITS4：56℃;EF1/EF2：53℃），72℃延伸45 s，共38个循环;72℃延伸10 min，4℃保存扩增产物。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。所有扩增产物均由生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果在NCBI进行BLAST比对。
1.3 哈茨木霉复合种鉴定
将经真菌通用引物ITS1/ITS4鉴定为哈茨木霉复合种的菌株，采用引物EF1728F（5′CATCGAGAAGTTCGAGAAGG3′）[10]和TEF1LLErev（5′AACTTGCAGGCAATGTGG3′）[11]对其EF1α序列进行PCR扩增，PCR反应体系和PCR反应程序见1.2，其中退火温度为53℃。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。所有扩增产物由生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果在NCBI进行BLAST比对。以GenBank中哈茨木霉复合种相关序列为参考序列，利用MEGA 5.2软件，采用邻近法（neighborjoining）构建系统发育树，进行哈茨木霉复合种下不同种的鉴定。
1.4 非洲哈茨木霉的致病性测定
将非洲哈茨木霉分离物在PDA培养基上28℃培养5 d，用无菌水冲洗菌落表面，获得分生孢子，经纱布过滤后，配制成孢子含量为1×106个/mL的孢子悬浮液，采用花丝通道注射法接种到授粉后3 d的玉米果穗上。收获前进行调查，记录发病情况。
2 结果与分析
2.1 真菌的分离鉴定
经形态学鉴定，54份样本中分离到的病原菌初步划分为镰孢属Fusarium spp.、木霉属Trichoderma spp.、青霉属Penicillium spp.、曲霉属Aspergillus spp.和丝核菌属Rhizoctonia spp.;分子生物学鉴定结果进一步表明分离到的病原菌分别为拟轮枝镰孢F.verticillioides、禾谷镰孢复合种F.graminearum species complex、层出镰孢F.proliferatum、哈茨木霉复合种T.harzianum species complex、棘孢木霉T.asperellum、黑曲霉A.niger、黄曲霉A.flavus、草酸青霉P.oxalicum、短密青霉P.brevicompactum和玉蜀黍丝核菌R.zeae。其中，除短密青霉外，其他真菌均是玉米穗腐病的已知致病菌。
2.2 真菌的分离频率
10种真菌中，拟轮枝镰孢的分离频率最高，为31.48%;哈茨木霉复合种次之，为24.07%;然后为草酸青霉，为14.81%。拟轮枝镰孢和哈茨木霉复合种在调查的5个县（或区）均有分布;草酸青霉仅在冠县未分离到;禾谷镰孢复合种仅在东昌府区、茌平县和阳谷县分离得到;黑曲霉仅在阳谷县和高唐县分离得到;黄曲霉仅在高唐县和东昌府区分离得到;玉蜀黍丝核菌仅在东昌府区和阳谷县分离得到;层出镰孢仅在东昌府区分离得到，棘孢木霉仅在高唐县分离得到，短密青霉仅在冠县分离到（表1）。
高唐县拟轮枝镰孢的分离频率最高，为45.45%，是该县的优势病原菌，哈茨木霉复合种次之，仅为18.18%;东昌府区哈茨木霉复合种的分离频率最高，为27.27%;冠县拟轮枝镰孢的分离频率最高，为60.00%，是该县的优势病原菌;在茌平县，拟轮枝镰孢、哈茨木霉复合种、草酸青霉和禾谷镰孢复合种的分离频率相差不大;阳谷县拟轮枝镰孢和哈茨木霉复合种的分离频率相同，均为29.41%，远高于其他病原菌的分离频率（表1）。
1） 各地点后面括号中的数字代表该地点的样本数。
The numbers in brackets following the region represent the sample numbers at this location.
2.3 哈茨木霉復合种鉴定
用EF1α基因特异引物扩增出一条约为1 300 bp的片段，利用MEGA 5.2软件，将哈茨木霉复合种分离物的EF1α基因序列与NCBI上已有的贵州哈茨木霉、哈茨木霉、西蒙斯哈茨木霉、非洲哈茨木霉等采用邻近法（neighborjoining）构建系统发育树，结果表明，11个哈茨木霉复合种分离物均与非洲哈茨木霉聚在同一分支上，表明其为非洲哈茨木霉Trichoderma afroharzianum（图1），且在高唐县、东昌府区、冠县、茌平县和阳谷县均有分布。
2.4 非洲哈茨木霉的致病性测定
将鉴定为非洲哈茨木霉的病原菌接种玉米果穗后，玉米苞叶过早干枯，且在苞叶表面覆盖绿色和白色霉层（图2a）;果穗发生腐烂，不结實或结实籽粒较少（图2b～c）。将发病组织进行病原菌分离纯化，经形态和分子鉴定仍为非洲哈茨木霉。
3 结论与讨论
国内外研究表明，玉米穗腐病的致病菌主要为拟轮枝镰孢及禾谷镰孢复合种，在本研究中，引起聊城市仓储玉米穗腐病的优势病原菌为拟轮枝镰孢，占分离频率的31.48%，但次优势病原菌为哈茨木霉复合种，占分离频率的24.07%，而禾谷镰孢复合种的分离频率仅为9.26%，这可能与哈茨木霉对禾谷镰孢复合种有较强的抑制作用有关[12]。
玉米收获前后易受到各种产毒真菌侵染，生长阶段易感镰孢菌，储存阶段易染曲霉[4]。在19世纪70年代美国就有关于贮存期引起玉米穗腐病青霉种类的报道[13]。在本研究中，虽然曲霉和青霉的分离频率均高于生长阶段采集样本的分离频率[14]，但远低于拟轮枝镰孢和哈茨木霉复合种的分离频率。这可能是由于哈茨木霉生长速度快、繁殖能力强、适应范围广等特性有关[15]。
近年来，关于哈茨木霉的研究主要集中在对植物病害的生物防治方面[16]，而关于哈茨木霉是病原菌的研究较少。姚瑞丽通过柯赫氏法则证实哈茨木霉是玉米穗腐病的致病菌[17]。在我国，关于哈茨木霉复合种的研究较少。张广志等在我国土壤中分离到哈茨木霉复合种中的非洲哈茨木霉、深褐木霉和西蒙斯木霉[18]。采用rDNAITS片段进行分子鉴定，只能将哈茨木霉鉴定到复合种水平，因此，多采用EF1α基因序列对哈茨木霉复合种进行鉴定，本研究将从玉米籽粒样本上分离到的哈茨木霉复合种均鉴定为非洲哈茨木霉。按照柯赫氏法则对非洲哈茨木霉分离物进行致病性测定发现，非洲哈茨木霉能够引起玉米穗腐病，且能够侵染玉米的苞叶、籽粒和玉米轴，使玉米苞叶过早干枯，玉米结实率降低，严重影响玉米产量，病害症状与田间的木霉穗腐病相同。但非洲哈茨木霉是否对玉米质量有影响，有待进一步研究。
研究表明，玉米水分活度、环境温度是决定储存玉米籽粒霉变的主要因素。玉米籽粒含水量高或环境温度和湿度波动大可能导致玉米霉变[4]。因此，明确引起仓储玉米籽粒霉变病原菌的种类，可为进一步防治玉米仓储病害提供理论依据。
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（责任编辑：杨明丽）
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