SSH技术在丝状真菌功能基因筛选中的应用

摘要：抑制性消减杂交（SSH）技术是基于抑制性PCR和消减杂交技术发展起来的一种高效分离差异表达基因的方法。因其具有特异性高、假阳性率低、背景低、快速高效等特点，已广泛应用于丝状内生真菌功能基因筛选中。主要对抑制性消减杂交技术的原理、技术流程、特点及其在丝状真菌生长发育、代谢活性物质及致病基因等方面的应用作简要综述。

关键词：抑制性消减杂交（SSH）技术；差异基因；丝状真菌；筛选

中图分类号：Q949.32；Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）03-0500-05

近年来随着分子生物学的不断发展，差异表达基因已逐渐成为功能基因组学研究的热点，分离、克隆、敲除某些具有特定功能的差异表达基因可为进一步揭示生物性状的调控机制奠定基础。目前，用于差异表达基因研究的技术主要有差异显示PCR （Differential display PCR，DDRT-PCR）、代表性差异分析PCR（Representational difference analysis PCR，RDA-PCR）、抑制性消减杂交（Suppression subtractive hybridization，SSH）技术、互补脱氧核糖核酸扩增片段长度多态性技术（DNA amplified fragment length polymorphism，cDNA-AFLP）、cDNA微阵列（cDNA microarray）技术、限制性酶切片段差异显示（Restriction fragment differential display PCR，RFDD-PCR）。其中SSH技术是一种以抑制性PCR反应为基础，将标准化测试cDNA单链步骤和消减杂交步骤合为一体的高效分离差异表达基因技术。该技术具有操作简便、特异性高、假阳性率低、灵敏度高、重复性好、周期性短、背景低、一次可同时分离上百个差异基因等优点，因其独特的优越性而被广泛应用于差异表达基因的研究中。丝状真菌是传统发酵工业中抗生素、酶制剂和有机酸的主要生产者，在自然界中扮演着各种复杂有机物分解者的角色，也是植物和动物疾病的主要病原微生物，研究与丝状真菌物质代谢、合成、致病相关的差异表达基因，可为进一步筛选丝状真菌的功能基因，并阐明其在各种生物过程中的调控机制提供理论依据。近年来，SSH技术凭借其独特的优越性，被广泛应用于丝状真菌物质代谢、合成、生长发育及致病相关基因等的研究中。本文主要对SSH技术在丝状真菌差异表达基因的研究和应用进行综述。

1 SSH技术

1.1 SSH技术的原理

SSH技术是由Diatcheuko等[1]发现的一种比较和分离不同细胞系、不同组织间或同一细胞系、同一组织间在不同条件下的差异表达基因的技术。SSH以抑制性PCR技术为基础，并与均一化和消减杂交技术相结合，在非目的双链DNA片段两端连接相同的接头，使其具有反向末端重复序列，从而抑制非目的片段的扩增，以达到选择性扩增目的片段的目的。均一化可保证低丰度差异表达基因不被丢失，而高丰度差异表达基因又不被过量分离。消减杂交则可以消除试验组（Tester）与对照组（Driver）的同源序列，形成一种e型分子（e型分子的两个5′端有两个不同的接头），从而确保差异表达基因片段进行指数扩增。

1.2 SSH技术的基本步骤

SSH技术主要包括cDNA合成与酶切、接头连接、两轮消减杂交和两轮选择性PCR扩增等步骤。首先分别提取试验组和对照组总RNA、纯化mRNA，反转录mRNA合成双链cDNA。用Rsa Ⅰ等内切酶分别将两组cDNA酶切，使其变为平均长度为600 bp左右的平末端双链cDNA片段。然后将酶切后的试验组cDNA分为两份，一份与接头1连接，另一份与接头2连接。再分别向连接不同接头的试验组cDNA中加入过量的对照组cDNA，进行第一轮消减杂交，杂交完毕后形成a、b、c、d 4种产物，a是单链试验组cDNA，b是自身退火的试验组双链cDNA，c是试验组和对照组的异源双链cDNA，d是对照组cDNA。在两份第一轮杂交产物中分别再加入新鲜变性对照组cDNA进行第二轮杂交，进一步消除试验组和对照组共有序列。第二轮杂交完毕后，将接头补平，然后进行两轮选择性PCR。第一轮PCR以接头外侧序列为引物结合位点，其中只有差异表达基因目标片段形成的e型分子以指数级大量扩增，而其他分子不能扩增或只能线性扩增；第二轮PCR扩增时，以接头内侧序列为引物结合位点，进一步选择性扩增目标片段，从而极大提高扩增的特异性并降低非目的片段的背景干扰，使最终的PCR产物中绝大部分为e型分子。

1.3 SSH技术的优点与缺点

SSH技术具有操作简便、快速高效、假阳性率低等优点。该技术克服了差异显示、代表性差异分析等技术假阳性率高、杂交次数多等缺陷，可同时分离数十个甚至数百个差异表达基因，经过一轮消减杂交，即可实现对差异表达基因1 000～5 000倍的富集，筛选周期相对其他基因分离方法大大缩短。SSH技术还可保证高、低丰度差异表达基因都能有效分离，克服了差异显示法中低丰度差异表达基因不易被分离的缺点。高富集度、低背景和消减混合物中cDNA丰度的均一化也是抑制性消减杂交技术成为快速克隆差异表达基因的理想方法的主要原因之一。SSH技术与其他基因分离技术相比也存在一些不足。SSH技术一次不能同时进行数个样本之间的分析研究，它不适于检测较复杂和cDNA较长的样本的差异表达基因。在消减杂交过程中，消减文库中cDNA已经被酶切，不再是全长cDNA，给差异表达基因全长cDNA序列的获得带来较大难度和巨大的工作量；SSH技术无法筛选出完全无酶切位点或酶切位点较少的基因片段，非酶切位点区域内出现的点突变、小缺失或插入序列也不能被有效地发现。

2 SSH技术在丝状真菌研究中的应用

2.1 SSH技术在丝状真菌物质合成和代谢相关基因筛选中的应用