产漆酶真菌的筛选及发酵产酶条件的优化

材料和方法

1.1 材料与仪器 菌种：金针菇、秀珍菇、鸡腿菇、黑木耳，购于滨海利农菌业，经天津天狮学院生物工程实验中心扩大培养用于实验。

试剂：愈创木酚（2-甲氧基酚）购于国药集团化学试剂有限公司;蔗糖、葡萄糖、琼脂粉购于天津市风船化学试剂科技有限公司;土豆、豆粕购于沃尔玛超市。

仪器：赛多利斯天平BSA124S，德国产;恒温培养摇床HNY-200B，天津欧诺产;紫外可见分光光度计UV1000，上海天美产;台式高速离心机TG16K-II，长沙东旺产;高压蒸汽灭菌锅MJ-78Q，上海施都凯产;超净工作台SW-CJ-2G，苏州净化产。

1.2 试验方法

1.2.1 液体培养基的制备 将1L去离子水倒入电磁炉中，加入200g土豆，大火煮沸后温火煮20min，8层纱布过滤，用蒸馏水定容至1L。加入葡萄糖20g，pH调到6.0作为基本培养基。根据试验设计的需要，在基本培养基中添加不同蔗糖、豆粕作为碳源和氮源。

1.2.2 菌种培养 将4种斜面菌种接种到综合PDA平板上25°C活化培养14d。在超净台下，用打孔器取长势一致的菌丝，接种于液体培养基中，于25°C、180r/min摇瓶培养8d，收集菌丝体悬液作为液体菌种。接种时，在超净台下用移液枪精确吸取2mL加入到不同试验组，在25°C、180r/min摇床中培养。

1.2.3 漆酶活力测定 超净工作台中取待测样发酵液500μL，台式离心机中4000r/min离心5min，上清液即为粗酶液。酶活性测定体系为3mL，其中0.1mol/L，pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲液2.7mL，适当稀释的粗酶液0.1mL和0.5mol/LABTS溶液0.2mL。25°C水浴锅中反应3min后，迅速转入冰水以终止反应。用紫外可见分光光度计测定420nm处反应吸光值的变化。定义1min氧化1μmolABTS所需的酶量为1个酶活力单位（U/L）。每个样品3个重复，以煮沸灭活粗酶液为对照。漆酶活性计算公式[10-11]如下：

[∆ OD×V1∆ t×V2×ε420]×106×稀释倍数

式中：ε420（ABTS）=3.6X104L/（mol·cm）;△t=1min;△OD为1min内吸光度的变化值;V1为酶反应中反应液的总体积，3mL;V2为酶反应中酶液的体积，0.1mL。

1.2.4 产漆酶菌株的筛选 将活化的菌株接种到以愈创木酚为底物的培养基上培养，定时观察菌落生长和菌落周围颜色深浅变化情况。选出颜色适中且没有明显抑制作用的显色圈的菌株。每天定时观察菌落形态的同时，测定变色圈的出现时间、测量变色圈直径和记录变色圈颜色深浅，通过上述方法比较得出不同菌种的产漆酶能力[12-13]。

1.2.5 单因素试验 （1）pH在基本培养基中加入适量的氢氧化钠溶液或盐酸溶液，将pH分别调试至3、5、6、7、9。温度为常温25°C，C/N为1∶5，每个水平做3次，取平均值。培养后测定并记录结果。（2）温度对菌种产漆酶的影响：改变恒温培养箱的温度设定，使其为20、25、28、30、35°C，pH调试至6，C/N为1∶5，每个水平做3次，取平均值。培养后测定并记录结果。（3）培养时间：设定培养时间为3、5、7、9、11d，pH调试至6，保持室温25°C，C/N为1∶5，每个水平做3次，取平均值。培养后测定并记录结果。（4）培养基中碳氮比：在基础培养基中保证温度为常温25°C，pH调试至6，碳源氮源总量不变的情况下，改变C/N（蔗糖/豆粕）比例（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1），每个水平做3次，取平均值。培养后测定并记录结果。

1.2.6 正交试验 根据1.2.4单因素试验研究中的实验结果，从每种单因素中各自选取3个水平进行L9（34）正交实验设计。选出最优的条件后，根据最优条件做3次重复试验，验证结果。

2 结果与分析

2.1 不同菌种的产漆酶能力 在常温条件下用1.2.4中的方法对4种菌种进行培养，首先选择无明显抑制作用和出现变色圈时间较短的培养基，然后在其中选择变色圈颜色适中、直径较大的菌种。进行1.2.5漆酶活力测定。结果见表1，由表1可知，在相同条件下，金针菇产漆酶活力最强，其余菌株较低，故选用金针菇作为后续实验的试验菌种。

2.2 pH对产漆酶能力的影响 由图1可见，随着pH的增大，金针菇菌种发酵产漆酶的酶活力先升高后降低。在pH=5时，漆酶活力最高（235U/mL）、漆酶的产量最多;pH继续增加可能会对金针菇的生长产生部分抑制作用，分泌的漆酶产量下降。由此可见，在培养的过程中，过高过低的pH既不利于发酵产漆酶，又不利于金针菇的生长。

2.3 温度对产漆酶能力的影响 由图2可见，随着温度的改变，针菇菌种发酵产漆酶的酶活力先升高后降低，但总体影响并不明显，28°C时出现峰值。生产漆酶时，可以考虑不用调整温度，保持室温即可，但不宜偏高或偏低，因为温度较高或较低都会抑制金针菇产漆酶的活力。

2.4 培养时间对菌种产漆酶的影响 由图3可见，随着时间的延长，金针菇菌种发酵产漆酶的酶活力先升高后降低，在时间为7d时活力最高（311U/ml）、漆酶的产量最多。若继续延长培养时间，漆酶会被降解导致酶活力降低，所以在培养过程中培养时间不宜过长。

2.5 培养基中碳氮比的不同对漆酶的影响 由图4可见，在碳源氮源总量不变的情况下随着碳源的增加，其菌种产漆酶的活力逐渐提高。在碳氮比为10∶1到20∶1范围内金针菇产漆酶活力最高。

2.6 正交实验结果及分析 根据单因素实验的结果，从这3种单因素中各自选取3个水平进行L9（34）正交实验设计（表2）。正交实验结果见表3，由表3可知，影响金针菇发酵产漆酶量多少的主要因素是培养基的碳氮比，其次是发酵时间，然后是发酵培养基的初始pH，最后是发酵温度。温度对发酵过程中产漆酶的影响比较小，所以在发酵过程中保持室温就可以。把控好发酵时间以免培养时间过长导致漆酶被降解，产漆酶量降低。

2.7 结果验证及分析 按照2.5中最优的实验方案，进行3次重复试验，测得漆酶活力的数值为330U/mL，相对标准偏差小于5%，但是实验数值高于正交数值，证明此培养基条件为最适培养条件。

3 结论与讨论

根据实验最终确定金针菇发酵高产漆酶的最优条件是碳氮比为10∶1，pH为6，发酵温度为28℃，培养时间为5d，在实际生产中需要改变的因素比较容易，改动范围较窄，因此有利于实施，故此方案可作為高产漆酶的方案。

（责编：张 丽）