发酵液中分离提纯透明质酸

摘 要：透明质酸微生物发酵液中往往都含有蛋白质、核酸等杂质，因此需要分离纯化。只有高纯度的透明质酸才能更好的发挥其工业效用，但是分离纯化的方法却多种多样。目前主要方法有过滤法、凝胶层析法、离子交换层析法等，而不同的方法又将导致操作、成本、和纯度的不同。因此本文将从多方面多角度综合分析各种透明质酸分离纯化方法。

关键词：透明质酸多糖发酵分离提纯过滤凝胶层析离子交换

中图分类号：Q53文献标识码：A文章编号：1672-3791（2012）03（a）-0000-00

透明质酸( Hyaluronic acid，简称HA)又名玻璃酸，是一种由D-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸为结构单元的酸性高分子粘多糖。HA具有许多天然多糖共有的性质：呈白色，为无定形固体，无臭无味，有强吸湿性，溶于水，不溶于有机溶剂。它是一种国际上公认的生物大分子保湿剂，用于眼科显微手术、关节炎治疗、高档化妆品、食品添加剂等领域[1]。

1分离提纯透明质酸

发酵法生产的HA 具有分离精制容易，保湿性强，品质稳定，产量大等优点，目前已得到广泛使用，并已成为研究 HA生产的主要方向。由于微生物发酵液中提取的透明质酸粗品都含有菌体，杂蛋白、核酸等杂质，需要进一步分离纯化。以下简单介绍几种工业上常用的发酵液中透明质酸的分离提纯的方法：

1.1过滤法

过滤法分离纯化发酵液中的HA是一种简单有效并可以规模化生产HA的分离纯化方法，可以有效地除去菌体和杂蛋白，对分子量的影响相对较小。邓禹等[2]采用25g/L三氯乙酸灭活菌体并使蛋白质变性沉淀，以发酵液质量1.2% 的混合硅藻土为过滤助剂，过滤温度为 60℃，pH 为7.0的透明质酸发酵液预处理工艺，完全去除了透明质酸发酵液中的菌体和蛋白质等杂质。采用这一工艺得到的成品透明质酸中葡萄糖醛酸含量达46.39%，蛋白质含量仅为 0.047%，分子量为190万，提取收率为 91.3%。这种方法利用三氯乙酸灭活菌体并使蛋白质变性沉淀，然后以硅藻土作为过滤助剂吸附、截留蛋白质和菌体的透明质酸发酵液预处理方法。

1.2凝胶层析法

凝胶层析法是生物化学中一种常用的分离手段，凝胶层析是依据不同分离纯化目的和 HA 分子量大小选择合适的分子筛进行分离纯化的，透明质酸分子量达几十万到几百万，而蛋白质的分子量仅为几万，所以选择合适的凝胶可以起到分离纯化的效果。吴华昌等[3]采用葡聚糖凝胶G-100，以0.1mol/L氯化钠溶液为洗脱剂，以H A提取率与纯度为指标，对HA发酵液进行分离纯化，再用醇沉法提取HA，拟达到提高HA提取率和纯度的目的。在优化的凝胶层析条件下，HA提取率达到79.85%，蛋白质去除率为84.93%。

1.3离子交换层析法

如果采用化学方法从发酵液中分离纯化透明质酸，纯化过程中的p H值、光、热和还原剂等因素易导致其黏度发生不可逆的下降。而在进入HA纯化阶段后，由于离子交换层析等具有选择性吸附特点的层析技术已经成为分离提取生物大分子的有效方法。倪杭生等[4]采用强酸型阳离子树脂为交换剂的离子交换柱，和经组氨酸基团修饰的强碱型阴离子树脂为交换剂的离子交换层析柱串联。选择以氯化钠溶液为洗脱剂，在优化的洗脱条件下，对HA 粗品进行分离纯化，纯化重量收率为 58%～61%，分子量近100万。HA粗品溶液先通过交换柱，其中主要杂质蛋白质是两性物质，在偏酸性溶液中带正电荷，能与强酸型阳离子发生交换吸附而被纯化。

2透明质酸分离提纯方法的分析总结

从发酵液中分离提纯透明质酸是发酵法生产透明质酸的关键步骤之一，而目前报道的去除HA发酵液中菌体和蛋白质等杂质的方法有过滤法、凝胶层析法、离子交换层析法等。虽然过滤法具有设备简单、操作方便、试验重复性好、成本低廉，且能有效去除蛋白质类杂质，但提纯效率相对还是比较低的，这种方法通常只用于透明质酸的初期分离纯化。凝胶层析是基于被分离组分之间的分子量大小不同而起到分离的效果，这样就避免了化学方法纯化HA过程中的pH、酶、光、热和还原剂等因素导致糖苷键的水解或分子间解聚，避免了黏度发生不可逆的下降。但凝胶层析法成本较高，且分离提纯HA的提取率也比较低。离子交换法基于被分离组分与交换剂之间存在的静电作用，离子交换层析分离条件温和，不引起分子结构的变化，这具有很强的优越性。与化学提取法相比，离子交换法的提取率还较低，离子交换树脂的化学修饰比较困难，因此在离子交换剂的选择以及离子交换树脂的基团修饰方面还需要进一步的研究。面对这诸多问题每种分离纯化方法也都存在一定的局限性，单一的分离纯化方法并不能达到很高的纯化程度，只有根据制备HA的不同要求在不同阶段选择适当的分离纯化的方法，并对工艺过程和方法进行系统优化，才能获得高纯度、高分子量的HA。因此从发酵液中分离纯化HA 往往是由多种分离纯化方法联合完成。所以，对于发酵液中透明质酸的提取方法还有待于进一步的研究探索。

3透明质酸展望

2004年全球的H A在化妆品和医疗用途上，销售总值高达3 0～4 0亿美元，还以每年20％的递增率增长。在HA的研发上，国内外学者开始着重于对 HA 进行修饰及对其衍生物的应用进行研究，以解决纯H A易溶于水、 吸收迅速和在组织中停留时间短等特性。在HA 分离提纯工艺研究的重点将是对分离纯化方法优化组合，精细化操作，降低生产成本的同时提高分离纯化工艺的安全性，操作上的简捷性，探索适合于工业化生产的工艺路线，在提高 HA 纯度的同时尽量保持高的分子量。因此，H A的研发以及纯化工艺的改进将成为当前的发展趋势。

参考文献

[1] 孙尚志,张青春,张辉等.透明质酸（HA）的功能和生产进展[J].长春中医药大学学报,2007,23(3)88-89

[2] 邓禹,堵国成,李秀芬等.基于发酵液特性的透明质酸提取预处理工艺[J]. 过程工程学报,2007,7(2)380-384.

[3] 吴华昌,马钦元,等.凝胶层析在发酵液中分离提纯透明质酸中的应用[J].生物技术通报,2009,12:184-187

[4] 倪杭生,李润,贺艳丽等.透明质酸的离子交换层析纯化[J]. 中国医药工业杂志,2001,32(11):485-488.