茶叶多糖的提取与结构分析

材料与方法

1.1 材料与仪器 茶叶购于茶农，把准备好的干茶叶放入粉碎机中粉碎，将粉碎后过30目筛的茶叶粉末装好备用;无水乙醇、正丁醇、浓硫酸、苯酚、三氯乙烷、异戊醇等分析纯，上海国药生产。

恒温水浴锅（HH-8）：金坛市杰瑞电器有限公司;小型超微粉碎机（WK-150A）：山东省青州市精诚机械制造有限公司;真空干燥箱（OZF-0690）：上海新苗医疗机械制造有限公司;电子天平（FA2104N）：上海箐海仪器有限公司;台式低速离心机（TDZ4）：湖南赫西仪器有限公司;可见分光光度计（722）：上海奥普勒仪器有限公司;傅立叶变换红外光谱仪（Nicolet iS-200）：美国。

1.2 实验步骤

1.2.1 茶多糖测定方法 用苯酚-硫酸法[7]来测定茶叶多糖的浓度，以葡萄糖为标准品，配制成100mg/L的葡萄糖溶液。

茶叶多糖的提取率公式：提取率（%）=（C×稀释倍数×V×10-6）/m×100

式中：C为分光光度计间接测定的茶叶多糖的浓度;单位：mg/L;V为提取液体积;位：mL;m为样品质量;单位：g。

1.2.2 不同超声功率和时间下提取多糖

1.2.2.1 不同超声波功率提取多糖 称取待测10.0g茶叶粉5份，加入蒸馏水，在温度为60℃和超声功率分别为0、50、60、70、80W条件下提取1h。提取液用4层纱布过滤后静置3h，抽滤，滤液经离心，然后测定茶叶多糖浓度和提取率。

1.2.2.2 不同超声时间提取多糖 称取待测10.0g茶叶粉5份，加入蒸馏水，在温度60℃和功率70W条件下提取，超声提取时间分别为0.5、1、1.5、2、2.5h，提取液用4层纱布过滤后静置3h，抽滤，滤液离心，然后测定茶叶多糖浓度和提取率。

1.2.3 超声条件下单因素实验

1.2.3.1 温度对提取率的影响 称量10.0g茶叶粉5份，加入蒸馏水，在功率70W条件下，放置于温度不同的同一型号的超声波清洗仪中，设定水温分别为50、60、70、80、90℃，浸提1h，提取液用4层纱布过滤后静置3h，抽滤，滤液离心，然后测定茶叶多糖浓度和提取率。

1.2.3.2 料液比对提取率的影响 称量10.0g茶叶粉5份，分别加入100、200、300、400、500mL的蒸馏水，在功率70W条件下放置于60℃的超声波清洗仪中，浸提1h，提取液用4层纱布过滤后静置3h，抽滤，滤液离心，然后测定茶叶多糖浓度和提取率。

1.2.3.3 提取次数对提取率的影响 称量10.0g茶叶粉5份，加入蒸馏水，放置于60℃超声波清洗仪中，在功率70W条件下，分别提取1、2、3、4、5次，一次1h，提取液用4层纱布过滤后静置3h，抽滤，滤液离心，然后测定茶叶多糖浓度和提取率。

1.2.4 茶叶多糖脱蛋白 把多糖溶于20mL的蒸馏水中，并用三氯甲烷和正丁醇（4∶1）配制4份各10mL的sevag试剂，分别加入到多糖溶液中。充分振荡30min后放入到离心机上以3000r/min的速度离心1min。然后留下上清液，继续加入相当于多糖溶液1/3体积的sevag试剂，重复上述操作3次。向剩下的多糖溶液中加入2倍的无水乙醇，冷藏静置2h，然后离心3min，用水洗涤沉淀后，加入丙酮脱水，真空冷冻干燥12h，得到除掉蛋白的多糖。

1.2.5 红外与紫外实验 取少量除去蛋白的多糖，加蒸馏水溶解，在200～700nm的波长范围内进行紫外实验，保存所得光谱。取2mg精糖放入研钵中，并加入200mgKBr在研钵中充分研磨压片，然后在4000～400cm-1处进行红外光谱实验。

2 结果与分析

2.1 标准曲线 依据分光光度法在波长490nm处测定吸光度A490，绘制出标准曲线，如图1所示，得回归方程为：A=0.0128C-0.0547，R=0.9987。

2.2 不同因素对多糖提取率的影响

2.2.1 不同超声波功率对提取率的影响 由图2可知，随着超声波功率的增加，茶叶多糖提取率也呈现上升趋势，当超声波功率大于70W之后，提取率增加不明显，没有超声情况下提取率最低。

2.2.2 不同超声时间对提取率的影响 由图3可知，茶叶多糖提取率随着超声浸提时间的增加而逐渐升高，1h后，提取率增加缓慢，而随着时间的延长生产成本会增加，因此浸提时间应选在1h适宜。超声波可在液体中产生空穴作用，空穴作用产生的冲击波和射流可破坏植物细胞和细胞膜结构，从而增加细胞内溶物通过[8，9]。经过超声浸提比不经过超声浸提得到的多糖要多，而且超声提取的时间加长会增加多糖的提取，因此可以推断出超声在一定程度上有利于茶叶多糖的提取。

2.2.3 超声提取温度与提取率的关系 由图4可知，伴随温度的升高，多糖的提取率渐渐升高，这表明温度愈高对茶叶细胞的破坏作用愈大，有益于多糖的浸出。但在90℃左右時，虽然提取率达到1.63%，但茶叶提取液的粘度变得过大，这也许是因为：一是茶叶细胞在高温下会处于“崩溃”、溶解的状况;二是茶叶多糖中含有的淀粉在90℃时会处于糊化的状态，茶叶提取液就形成一种粘稠的糊状，而这种高黏的液体对固液分离不利[10，11]。所以在茶叶多糖的工业化生产中，提取温度不得超过90℃，在60℃时提取的多糖与在70℃时提取的多糖质量相差不大，随着提取温度的升高，分子热运动会变得更为剧烈，多糖提取率也会随之增加。由于多糖是活性物质，温度过高易破坏其结构，影响其生物活性，会对后面试验造成不利影响，所以初步推出60℃和70℃为最佳浸提温度。

2.2.4 料液比对提取率的影响 由图5可知，随着料液比的增加，多糖的提取率也会渐渐增加，但当料液比到达1∶30后，多糖的提取率的增加就变得迟缓。而体积的增加会延长浓缩时间，生产成本增加，所以料液比选择在1∶30较好。

2.2.5 提取次数对提取率的影响 由图6可知提取次数对多糖提取率的影响也较为突显，当提取次数从1到3次时，多糖提取率增加快速，从3到5次时，多糖提取率上升相当迟缓。所以，从节约成本和提高效率方面考虑提取次数选择3次适宜。

2.3 茶叶多糖的红外表征 图7是茶叶多糖在4000～400cm-1的波长范围内的红外光谱图，对照以上结果可知3650～3150cm-1处的较宽吸收峰是O—H和N—H伸缩振动峰，在2910cm-1周围存在的峰为甲基（—CH3）和次甲基（—CH2）的C—H伸缩振动的信号，1650cm-1处的峰是多糖水合吸收振动吸收峰，是由糖环上的糖苷键和酰氨基上的C[]O伸缩振动引起的，1360cm-1处的吸收峰是C—H键的变角振动，1240cm-1处的峰是C—O—C非对称伸缩振动峰[12]。887cm-1是吡喃糖苷的特征吸收峰，652cm-1出现吸收峰，表明茶多糖结构中存在酰胺基。

2.4 茶叶多糖的紫外表征 由图8～11用紫外扫描仪在200～700nm波长范围内进行扫描得到的结果可知：该紫外吸收光谱图在200～280nm波长处有吸收峰，说明其中含有肽键，表明多糖内含有蛋白质和核酸[13]。在图4中，温度升高会增加多糖的产量，但是温度过高会破坏多糖结构影响其活性，而且60℃和70℃下提取出的多糖相差很少，从节约能源的角度看，60℃为最佳浸提温度。在图7中可以看出，红外光谱的在1650cm-1左右出现吸收峰，这是多糖中C[]O伸缩振动引起的，但同时也是酰氨基上的C[]O伸缩振动引起的，这说明多糖中有蛋白质的存在[14]。由图8，图9，图10，图11可以看出，207nm处为茶多糖的特征吸收峰，274nm处为蛋白质吸收峰，无超声情况下，50℃和60℃时蛋白质的吸收峰较低，但是在70℃时蛋白质的吸收峰较高，说明温度增加了蛋白质的提取，在该温度下超声提取时，蛋白质的吸收峰明显降低，可能是超声引起了蛋白质的变性，从而引起蛋白质溶解度降低，说明超声对蛋白质提取有抑制作用。

4 结论

本实验对茶多糖提取工艺进行研究，通过对超声提取功率、提取时间、提取温度、料液比、提取次数进行单因素实验，得出最佳提取功率是70W，提取时间为1h，提取温度是60℃，料液比为1∶30，提取次数为3次。通过红外光谱和紫外光谱实验确定多糖中存在特征官能团，确定茶多糖是一种含有吡喃环和糖醛酸的蛋白多糖复合物[15]。

参考文献

[1]陈艺瑞，王川.“中国藏茶”的饮茶礼仪及饮茶程序[J].历史教学（下半月刊），2017（07）：50-53.

[2]刘凤琼，鄢灵君，陈法，等.饮茶与牙龈癌发病关系的病例对照研究[J].肿瘤防治研究，2017，44（02）：138-141.

[3]Chen K，Chen D，Lan C，et al. Does green tea consumption increase urinary oxalate excretion？ Results of a prospective trial in healthy men[J]. International Urology and Nephrology，2017（3）：1-5.

[4]Cao H. Polysaccharides from Chinese tea： recent advance on bioactivity and function[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2013，62（11）：76-79.

[5]Chen G，Yuan Q，Saeeduddin M，et al. Recent advances in tea polysaccharides： Extraction，purification，physicochemical characterization and bioactivities[J]. Carbohydrate Polymers，2016，153：663-678.

[6]黄谦，朱明扬，罗林根，等.基于主成分分析法的茶叶多糖提取工艺优化[J]. 食品工业科技，2018（17）：206-211.

[7]谢普军，黄立新，张彩虹，等.蒲公英茶与叶的化学成分测定分析[J].食品工业科技，2014，35（15）：346-351.

[8]余婉莎.桑枝多糖提取与结构分析及生物活性探究[D].重庆：西南大学，2018.

[9]李英.超声波辅助制备稻秆羧甲基纤维素及其吸附性能的研究[D].无锡：江南大学，2018.

[10]许子竞，石谦，罗树常.金花茶叶多糖的分离纯化及组成分析[J].天然产物研究与开发，2017，29（07）：1148-1153.

[11]曲伟，刘庄，张照康，等.毛尖茶叶多糖的提取分离及其活性测定[J].天然产物研究与开发，2016（8）：1262-1265.

[12]刘芳，赵声兰，陈朝银.质谱分析多糖结构的方法学进展[J].药物分析杂志，2011，31（8）：1612-1618.

[13]谢明勇，聂少平.天然产物活性多糖结构与功能研究进展[J].中国食品学报，2010，10（2）：1-11.

[14]高小荣，刘培勋.多糖结构分析研究进展[J].天津药学，2003，15（6）：68-72.

[15]张艳.茶多糖的分离纯化及其含片的制备工艺研究[D].合肥：安徽农业大学，2014.

（责编：王慧晴）