硝酸还原酶介导的一氧化氮对植物铝胁迫耐受性的增强作用

计划（编号：15IRTSTHN020）。

作者简介：王华华（1980—），男，湖北汉川人，博士，副教授，主要从事植物逆境生理研究。E-mail：hhwang04@163.com。

铝毒害是酸性土壤中限制植物生长和作物产量的主要因子[1]。植物遭受铝毒害最显著的1个特征就是根生长受到抑制，根尖是铝毒害的作用位点。当土壤pH值降低到5.5以下后，铝以毒害的形式进入到土壤溶液中抑制根系生长，从而阻碍植物对水分和矿质营养的吸收，导致植物生长受抑制和作物产量下降[2]。因此，增强作物铝耐受性是提高酸性土壤中作物产量的一个关键因素，有利于解决食物短缺和生物能源生产这一难题。

研究发现，铝毒害会导致植物体内活性氧的过量产生，从而造成氧化胁迫伤害[3]。为了避免活性氧的过量积累，植物体内也形成了多种清除活性氧的机制，除了酶促抗氧化机制[如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）等]外，还存在非酶促抗氧化机制[如还原型抗坏血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）等][4]。AsA、GSH是清除活性氧的2种重要抗氧化物质，二者含量的高低与植物的抗逆性密切相关[5]。有报道表明，维持转基因植株中高水平的AsA和GSH含量可以增强植物对胁迫的耐受性[6]。但是对于铝胁迫下抗氧化机制的信号调节仍有待进一步研究。

一氧化氮（NO）是一种重要的信号分子，参与植物生长发育和多种环境胁迫响应[7]。植物体内有2条重要的产生NO的潜在途径：NO合成酶（NOS）和硝酸还原酶（NR）所介导的酶促途径[8]。拟南芥NO的相关突变体Atnoa1（NOS缺失突变体）和nialnia2（NR缺失突变体）现已广泛用来研究NO在植物中的生理功能，Atnoa1和nialnia2突变体表现为NO的积累减少。2种突变体均是由于NO产生途径中关键酶的基因发生突变，使得2种突变体的NO产生量少于野生型，为从遗传学的角度揭示NO在铝毒害中的作用提供了良好的材料。前期研究结果表明，NO可增强植物对铝毒害的耐受性[9]，但有关NO与植物抗铝毒害的关系研究主要是通过运用外源NO供体、NO合成酶抑制剂、NO清除剂等获得的药理学证据，还未有更直接的遗传学证据表明NO在铝毒害中产生的作用以及铝毒害下NO的产生来源。本研究以NO相关突变体Atnoa1和nialnia2为材料，从遗传学角度进一步探讨NO在铝胁迫下植物耐受性的作用。

1材料与方法

1.1供试材料

拟南芥野生型（WT，Col-0型）、Atnoa1（NO合成酶缺失）和nialnia2（硝酸还原酶缺失）突变体植株。

1.2材料培養

首先将拟南芥种子用10%次氯酸钠消毒15 min，然后用无菌水清洗3次，再将种子点播在含3%蔗糖、0.8%琼脂的1/2 MS培养基（pH值=5.7）上。4 ℃春化3 d后，将培养皿转至培养间垂直放置生长，培养条件：22 ℃、14 h光周期[光照度120 μmol/（m2·s）]、相对湿度为70%。

1.3材料处理

将生长10 d的拟南芥幼苗轻轻地从琼脂板上移出避免伤害到根，然后转移到含有不同浓度（0、25、50、100、200 μmol/L）AlCl3的1/2 MS培养基（pH值=4.5）琼脂板上培养处理3 d。处理完毕后，将苗用蒸馏水洗净后用于参数测定分析。

1.4测定方法

处理完成后收集拟南芥幼苗用于各项指标的测定。根相对伸长量的测定，用相机对处理后的拟南芥根部进行拍照，根长用ImageJ软件进行分析，每个处理至少分析30条。丙二醛、H2O2和O-2[KG-*2]· [KG-*3]含量测定参照Wang等的方法[9]；AsA和GSH的测定参照de Pinto等的方法[10]进行。当粗提液中不加入二硫苏糖醇时，此时测得的数值为还原型AsA的含量。GSH的含量是总的谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的差值；所测指标测定时至少重复3次，取平均值。

2结果与分析

2.1不同AlCl3浓度处理对野生型、Atnoa1和nialnia2突变体根生长的影响

根生长抑制是植物遭受铝毒害最为显著的一个特征。为检测拟南芥对铝胁迫的敏感性，本研究检测不同铝浓度（0～200 μmol/L）[JP2]对根生长的影响。如图1所示，在无铝处理的培养基中，所有供试材料的根系生长均正常。铝处理条件下，随着铝浓度增大，所有植株的根系伸长均呈现剂量效应关系抑制。野生型和Atnoa1突变体的根长变化趋势相似，而nialnia2突变体的根系生长抑制程度更为明显。例如，当用浓度为 100 μmol/L 的AlCl3处理后，野生型、Atnoa1突变体和nialnia2突变体根长抑制率分别达到41.7%、45.8%和 74.8%。这些结果说明nialnia2突变体比野生型表现出对铝更敏感。

2.2铝胁迫对野生型、Atnoa1和nialnia2突变体中MDA和活性氧含量的影响

MDA和活性氧含量是衡量氧化胁迫程度的2个重要指标。为了查明铝毒害诱导的根生长抑制是否由于遭受氧化伤害所导致，本研究检测了铝胁迫对MDA和活性氧含量的影响。如图2、图3、图4所示，在无铝培养基中，所有供试材料中丙二醛（MDA）和活性氧（H2O2和O-2[KG-*2]· [KG-*3]）含量均无显著差异。50 μmol/L的AlCl3处理下，拟南芥中MDA、H2O2和O-2[KG-*2]· [KG-*3]的含量均显著增加，野生型和Atnoa1突变体表现出一致的增加趋势，而nialnia2突变体中MDA、H2O2和O-2[KG-*2]· [KG-*3]含量增加幅度更大。在野生型中，铝胁迫下MDA、H2O2和O-2[KG-*2]· [KG-*3]的含量比对照分别增加39.3%、48.8%和58.3%；在Atnoa1突变体，铝胁迫下MDA、H2O2和O-2[KG-*2]· [KG-*3]的含量比对照分别增加417%、48.4%和60.0%；在nialnia2突变体中，铝胁迫下MDA、H2O2和O-2[KG-*2]· [KG-*3]的含量比对照分别增加了 103.2%、1216%和113.7%。这些结果也说明nialnia2突变体比野生型受到了更为严重的氧化胁迫伤害。

2.3铝胁迫对野生型、Atnoa1和nialnia2突变体中AsA和GSH含量的影响

还原型抗坏血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）是体内2种重要的小分子抗氧化剂，能够清除体内过量活性氧，维持细胞内氧化还原平衡状态，从而避免细胞遭受氧化伤害。为进一步查明铝脅迫下nialnia2突变体比野生型对铝更敏感以及遭受更严重的氧化伤害的原因，本研究检测了铝对AsA和GSH含量的影响。如图5、图6所示，在野生型和突变体对照植株中，AsA和GSH含量均无明显差异。50 μmol/L AlCl3处理下，拟南芥中AsA和GSH的含量均显著增加，野生型和Atnoa1突变体均表现出类似的增加趋势，而nialnia2突变体中AsA和GSH含量增加幅度最小。铝胁迫下，野生型、Atnoa1突变体和nialnia2突变体中AsA增加量分别达到72.5%、73.6%和22.6%，GSH增加量分别达到41.8%、45.1%和17.0%。这些结果说明铝胁迫下nialnia2突变体中AsA和GSH含量增加幅度最小，其清除活性氧的能力也最弱。

3结论与讨论

[JP2]铝毒害会引起植物一系列生理生化进程的改变，从而导致植物根的生长及其功能受到抑制，最终造成作物减产。然而，所幸的是植物在遭受铝毒害时，不同的植物体内可形成不同的耐受铝毒害的机制[11]。有大量研究表明，NO作为信号分子参与了多种环境胁迫响应，如盐胁迫、干旱胁迫、低温胁迫、臭氧胁迫等[12]。因为植物细胞内存在一氧化氮合成酶（NOS）和硝酸还原酶（NR）2条NO产生的酶促途径，所以用NO合成酶突变体Atnoa1、硝酸还原酶nialnia2突变体作为试验材料，以研究分别阻断这2种NO合成途径后对拟南芥耐铝能力的影响。先前的药理学证据表明，NO参与了植物对铝毒害的耐受性[9]，然而在遗传学上的直接证据还未有报道。

植物根生长受到抑制是植物遭受铝毒害时一个最显著的特征。本研究结果显示，铝毒害明显地抑制了拟南芥根的生长（图1），表明拟南芥植株遭受到了铝毒害；进一步的结果显示，nialnia2突变体比野生型拟南芥和Atnoa1突变体对铝毒害更敏感（图1），表明硝酸还原酶途径产生的NO可能参与了植物对铝毒害的耐受性。

有报道表明，铝毒害可对植物造成氧化胁迫，从而导致植物质膜脂质过氧化[13]。植物细胞中活性氧的过量累积是对植物遭受铝毒害的一种反应[3]。为了进一步探讨NO增强植物对铝毒害耐受性的机制，本研究检测了铝毒害对野生型拟南芥和nialnia2、Atnoa1突变体中MDA和活性氧含量的影响。研究结果表明，铝毒害明显地增加了拟南芥植株中MDA和活性氧的含量，而且nialnia2突变体植株中增加的幅度最大（图2、图3、图4），这些结果表明硝酸还原酶依赖的NO可能通过减轻植物遭受氧化胁迫程度从而增强植物对铝毒害的耐受性。为了进一步查明NO缓解植物铝诱导的氧化胁迫机制，本研究进一步检测了铝胁迫对野生型和突变体中AsA和GSH含量的影响。结果显示，铝增强了植株中AsA和GSH的含量，但是nialnia2突变体植株中增加的幅度最小（图5、图6）。这些结果表明，NO缓解铝诱导的氧化伤害是通过调节AsA和GSH含量来清除过量活性氧而实现的。

综上所述，本研究结果进一步证实NO参与了植物对铝毒害的耐受性，而且硝酸还原酶途径产生的NO参与了这一过程，NO通过调节AsA和GSH含量来清除过量活性氧，从而维持细胞内一个相对稳定的氧化还原平衡状态，避免细胞遭受严重的氧化伤害，以此来适应铝胁迫环境。然而，对于NO增强植物对铝毒害耐受性的具体作用机制还有待进一步更深入地研究。

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