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! Rۃ@H餳4 H Ҷ騮w"LK=#@HV"http://www.hbzzbh.com/k/cailiao/" target="_blank" class="keylink">材料与方法
1.1 实验动物 雄性SD大鼠30只，体重200～250 g，由山西医科大学实验动物中心提供。
1.2 主要试剂 丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；LPS测定鲎试剂盒（上海伊华临床医学科技公司）；TNF-α放免试剂盒（解放军总医院科技开发中心放免所）；CD68小鼠抗大鼠单克隆抗体（Abcame公司），二抗免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），TUNEL检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 实验动物分组及模型建立 30只雄性SD大鼠均给予标准基础饲料，自由进食饮水3 d后，设立9周组：Synthetic diet+saline 组、Synthetic diet+LPS组、Regular diet+LPS组、Regular diet+saline组，每组5只。另外设立5周组，Synthetic diet组与Regular diet组，每组5只，在第5周末麻醉处死该组大鼠以观察高糖高脂对大鼠肝脏影响。Synthetic饮食配方为含68.75%普通饲料+20%猪油+10%蔗糖+1%胆固醇+0.25%胆酸。自第6周开始，9周组大鼠在相同条件下隔天皮下注射LPS 0.5 mg/kg或相同剂量的0.9%氯化钠注射液，所有大鼠自由进食与饮水。在实验第9周末，1%戊巴比妥钠3 mL/kg腹腔注射麻醉动物，无菌无热原条件下取腹主动脉血，3500 rpm离心后取血浆备用，取肝左叶10%福尔马林固定，石蜡包埋5 μm切片备用，余肝组织置于-70 ℃冰箱备用。
1.3.2 病理学检查 石蜡切片做HE染色，在光镜下观察肝组织病理变化。
1.3.3 生化指标检测 放免法测定血浆TNF-α水平；赖氏2、4-二硝基苯肼比色法测定血浆ALT活性，鲎试剂法测定血浆LPS水平，实验过程均严格按照试剂盒说明书进行检测。
1.3.4 免疫组织化学方法 石蜡切片免疫组化检测肝组织中CD68（巨噬细胞分子标记物）的表达，在400倍光镜下，每组取5张，每张随机选取取5个视野，运用Image-Pro Plus 6.0软件进行光密度值的测定。CD68表达阳性为光镜下细胞腺呈棕黄色颗粒。
1.3.5 TUNEL染色法 在400倍光镜下，每组取5张，每张切片随机选取5个视野，计算凋亡细胞数与总细胞数比值，测定细胞凋亡率。
1.4 统计学处理 本实验数据均采用SPSS 15.0统计学软件处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验或单因素方差分析，计数资料的比较采用 字2检验，采用Pearson’s相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肝脏组织学观察 光镜下5周Regular diet组大鼠正常肝组织肝小叶结构完整，肝细胞核圆位于中央，呈条索状排列整齐，以中央静脉为中心呈放射状排列，肝细胞内未见脂滴（图1A）；而5周Synthetic diet组肝细胞体积增大，胞浆内可见小泡脂滴，肝细胞呈轻度脂肪变性，细胞轮廓模糊（图1B）。
2.2 各组生化指标检测结果比较 Synthetic diet+LPS组血浆LPS、ALT、TNF-α水平均显著高于Regular diet+LPS组和Synthetic diet+saline组比较差异均有统计学意义（P<0.05），血浆LPS、ALT、TNF-α表达水平分别为后两者的1.4～3倍、
1.2～4倍、1.3～2倍。Synthetic diet+saline组与Regular diet+saline组相比血浆LPS、ALT、TNF-α均显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。而Regular diet+LPS组血浆LPS、ALT与TNF-α水平与Regular diet+saline组比较差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。
2.3 各组免疫组化检测结果比较 Regular diet+saline组肝组织较少见CD68阳性单核巨噬细胞浸润，Regular diet+LPS组阳性表达量也无明显变化，与Regular diet+saline组比较差异无统计学意义（P>0.05）；Synthetic diet+saline组CD68阳性表达量与Regular diet+saline组比较明显增多（P<0.05）；而在Synthetic diet+LPS组可见大量巨噬细胞浸润，Synthetic diet+LPS组（1.24±0.36）与Synthetic diet+saline 组（0.76±0.18）、Regular diet+LPS组（0.41±0.11）比较差异均有统计学意义（P<0.05），见图2～3。
2.4 各组肝细胞凋亡变化比较 在光镜下，正常肝细胞细胞核为蓝色，凋亡细胞细胞核为棕黄色，正常对照组（Regular diet+saline组）偶见少量的肝细胞凋亡，Regular diet+LPS组可以看到肝细胞凋亡数量无明显变化，凋亡率与Regular diet+saline组比较差异无统计学意义（P>0.05）；而在Synthetic diet诱导建立的NASH大鼠模型中，肝细胞凋亡率明显升高，Synthetic diet+LPS组肝细胞凋亡率达到最高值，与Synthetic diet+saline组、Regular diet+LPS组比较差异均有统计学意义（P<0.05），见图4～5。
2.5 相关性分析 经Pearson’s相关性分析，CD68阳性表达与TNF-α水平呈显著正相关（r=0.64，P<0.05）。
3 讨论
本研究采用高脂高糖饮食诱导建立大鼠非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）模型，在喂饲5周高脂高糖饮食的基础上，自第6周开始隔天皮下注射内毒素（LPS）0.5 mg/kg或相同剂量的0.9%氯化钠注射液，来观察肝脏细胞凋亡变化特点。研究结果显示Regular diet+LPS组大鼠肝脏并无明显脂肪病变，血浆LPS水平和肝损伤指标血浆ALT表达与Regular diet+saline组相比亦无显著变化；Synthetic diet+LPS组血浆LPS水平进一步升高、ALT表达亦明显进一步增加，肝功能受损加重，与Synthetic diet+saline组相比差异有统计学意义（P<0.05），提示同样剂量的LPS对正常肝脏不具损伤作用，而对在高糖高脂饮食的作用下发生轻度脂肪变性的肝脏造成了进一步损伤，使肝脏原有疾病加重，对肝脏形成第二次大击，促进了大鼠NASH的病情进展。
CD68是巨噬细胞的标志物，能较好的反映巨噬细胞在组织中的浸润程度，通常采用免疫组化检测CD68阳性表达[7-8]。Mita等[9]的研究显示，肝内过多表达的巨噬细胞在暴发性肝衰竭患者发病机制中会起到关键性作用。本研究显示，Regular diet+saline组肝组织较少见CD68标记的阳性单核巨噬细胞浸润，经LPS处理后Reyular+diet+LPS组数量并无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05），而Synthetic diet+LPS组肝内CD68标记的阳性细胞数量明显高于Synthetic diet+saline组及Regular diet+LPS组，差异均有统计学意义（P<0.05），提示CD68分子标记的肝脏巨噬细胞在NASH的发病机制中发挥了一定的作用。
肿瘤死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）具有促炎活性和免疫调节作用，是机体免疫反应和炎症反应的重要介质[10-11]，可由激活的肝脏巨噬细胞分泌产生。革兰氏阴性杆菌细胞壁的主要成分LPS是肠源性内毒素的主要成分，是肝脏巨噬细胞最敏感的活化剂。据研究报道TNF-α的高表达与肝细胞凋亡具有显著的相关性[12]，Kudo等[13]的研究显示LPS 上调了TNF-α在NASH小鼠中的表达，并表明由TNF-α诱导的肝细胞凋亡增多。本研究结果发现Regular diet+LPS组与Regular diet+saline组比较，TNF-α的表达无明显变化，凋亡率也无明显差异，而在Synthetic diet+LPS组TNF-α的表达达到最大值，同时凋亡率也升到最高值，与Synthetic diet+saline组相比差异有统计学意义（P<0.05），本研究结果与Kudo等[13]的研究结果相一致，并进一步证实了在NASH中LPS会上调TNF-α表达，由TNF-α介导引起的肝细胞凋亡在NASH大鼠的发病机制中起着重要作用。
笔者认为在NASH大鼠中，因肠道黏膜屏障受损等原因，肠源性内毒素很容易进入全身血液循环，研究结果显示，Synthetic diet+LPS组血浆LPS水平与Synthetic diet+saline组相比显著升高，差异有统计学意义（P<0.05），提示NASH模型大鼠体内形成了LPS血症。据Rivera等[14]的研究报道，在NASH小鼠模型中CD14 mRNA的表达增强了细胞对LPS的敏感性，从而使LPS的生物活性大大增强[15-16]，LPS进入血循环后，其脂质A部分与LPS结合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP）形成复合物，通过与表达在巨噬细胞表面的相应受体结合，激活单核-巨噬细胞释放大量的TNF-α[17]，与表达在肝细胞膜的TNF受体结合导致肝细胞损伤，并由此介导肝细胞的凋亡，最终促进NASH的发展。
在对TNF-α水平的表达和CD68标记的阳性细胞表达进行Pearson’s相关性分析后，笔者发现在NASH中TNF-α的表达与CD68的表达呈明显的正相关[18-19]，推测NASH中LPS可激活巨噬细胞释放大量TNF-α，从而增强了TNF-α介导的肝细胞凋亡[20-21]，未来还需要做进一步研究来探讨LPS在NASH中的确切机制，为治疗NASH和肝硬化等疾病提供理论依据。
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