材料，而通过遗传转化，创新大量种质资源，是进行系统选育的前提。
1 花生组织培养
花生组织培养对花生的品种改良、新品种繁殖、遗传转化、种质保存和抗性突变体的筛选等具有重要意义。自20世纪50年代末期Steward培养花生韧皮组织开始，花生组织培养至今已有50多年的历史，近十几年来有关花生再生植株的研究逐渐增多。以花生植物茎尖、未成熟的合子胚、未成熟的叶片、子叶为外植体，进行离体培养并获得再生植株[1]（表1）。
苗利娟等[2]从22个花生品种中筛选出4个丛生芽高诱导率的花生品种，并指出花生种子在1/2MS培养基上萌发率比在MS培养基上稍高；添加500 mg/L羧苄青霉素（Carbenicillin）对花生幼叶丛生芽分化无抑制作用，丛生芽诱导率可提高13.5个百分点；头孢霉素（Cefalexin）对芽诱导具有抑制作用，丛生芽诱导率下降48.5个百分点。黄玲等[3]研究指出，幼叶外植体分化不定芽频率明显高于子叶、上胚轴和下胚轴；6 d叶龄的叶片中间切段为最佳；不同基因型不定芽分化率存在明显差异。
隋炯明等[4]以不同类型18个花生品种成熟种子的胚小叶为外植体，对不定芽诱导及植株再生的研究表明，所有供试品种芽点诱导率均高于60%，但五大类型间及品种间存在显著差异，龙生型平均诱导率最高，其次是珍珠豆型，多粒型最低。植株再生率差异显著，最高的是珍珠豆型，最低是多粒型。马彩霞等[5]以14份不同花生品种的胚小叶为外植体，筛选出最佳芽诱导培养基、伸长培养基和高效再生基因型。不同品种再生率在25.51%～93.01%，每个丛生芽伸长数达到7.24，时间缩短至21～28 d；并利用“弗落蔓生”在15 d内得到了生根组培苗。尤淑丽[6]选用外引及自选共8个花生品种胚小叶作为外植体，研究愈伤组织诱导率和不定芽分化率，结果表明，品种间愈伤组织诱导率和不定芽分化率均差异显著。徐娟等[7]对4个花生品种上胚轴及胚小叶的不定芽诱导及其成苗、生根试验发现，不同基因型花生品种的再生能力差异显著，其中湘花2008和中花8号的不定芽诱导率、成苗率和生根率均较高。
赵明霞等[8]指出，平阳霉素（PYM，Pingyangmycin）对体胚发生有显著的抑制作用，随着平阳霉素浓度的增大，体胚诱导率显著下降。2个供试品种花育20号和花育22号的抑制浓度不同，综合褐化率和体胚形成率，适宜的PYM离体诱变浓度分别为3～4 mg/L和4～5 mg/L，诱变培养时间为30 d。王莉莉等[9]在快中子辐照对花生胚小叶体细胞胚胎发生的影响研究发现，快中子辐照对诱导花生基因突变是有效的，推断14.0 Gy为适宜的诱变剂量。
刘艳芝等[10]以花生优良品种四粒红成熟种子胚轴为外植体，诱导体细胞胚发生率达到66.67%；体细胞胚在6-BA浓度逐渐降低的MS培养基上培养，发育成完整植株。蒋菁等[11]以花生品种“桂花30”和“桂花771”的胚小叶、下胚轴、子叶节为外植体，发现2，4-D的适宜浓度为10 mg/L，经过约30 d培养，可产生大量体细胞胚，平均诱导率分别为55.37%和36.72%，平均每个外植体产胚量分别为5.68个和4.27个。将诱导形成的体细胞胚转接到6-BA浓度逐渐降低的MS培养基上培养，体细胞胚萌发再生成无根小苗，正常植株再生率分别为32.6%和23.5%。将无根苗转接到生根培养基中可获得完整植株。戴梓茹等[12]研究表明，不同激素种类对花生根愈伤组织诱导率的影响程度为6-BA>KT>2，4-D。
噻重氮苯基脲（Thidiazuron，TDZ）是一种新型高效的植物生长调节剂，它能直接或间接诱导外植体从愈伤组织形成到体细胞胚胎发生的一系列过程，具有生长素和细胞分裂素双重作用的特殊功能[13-14]。研究发现，TDZ诱导的芽在伸长和生根上存在困难[15]。张月婷等[16]研究TDZ对不同基因型花生子叶节诱导丛生芽与扩繁中的作用，结果表明，丛生芽经扩繁后，虽能够不断新生丛生芽，但这些丛生芽的伸长和生根也存在困难，TDZ浓度越高，处理时间越长，丛生芽的再生越困难，这可能是由于TDZ长期的作用导致其再生能力下降。研究还发现，在萌发阶段用TDZ处理而诱导和扩繁阶段不添加TDZ时，产生的丛生芽较易伸长和生根，因此可考虑将扩繁的丛生芽经过一段时间不添加任何激素的恢复培养，再在含6-BA的伸长培养基上再生，以消除TDZ的抑制作用。
2 花生遗传转化
自1994年Eapen等[17]首次通过农杆菌介导法将外源基因整合到花生基因组以来，不断有文献报道了采用农杆菌介导法、基因枪轰击法和花粉管通道法等技术进行花生遗传转化的研究。
2.1 农杆菌介导法农杆菌介导途径主要是利用根癌农杆菌介导花生胚状体、胚小叶、幼叶、子叶、胚轴、胚根等外植体，通过抗生素或除草剂抗性筛选获得再生植株。相对于其他途径，该方法具有操作简便、不需昂贵设备、外源基因单拷贝或低拷贝整合、转化频率较高、遗传表达稳定性较好等优点；且在众多转基因植物中80%是由农杆菌介导转化的，因而农杆菌转化已成为研究者进行花生基因转化的首选方法。
FAD2基因编码的Δ12脂肪酸脱氢酶是植物产生多聚不饱和脂肪酸的关键酶，石新国等[18]构建了带有FAD2基因反义RNA干扰体和γ-TMT基因的种子特异表达单元的双价种子特异表达载体pCAMBIA1300AT，并通过农杆菌C58介导转化花生品种闽花6号，共得到21棵再生植株，PCR检测结果表明，其中有3株为阳性苗，表明该完整表达单元的片段已整合到花生基因组中。殷冬梅等[19]在培育高油酸的花生新种质的研究中，以农杆菌为介导将含有油酸脱氢酶基因的植物双元表达载体pFGC/2nd转入花生，发现RNA干扰对内源的油酸脱氢酶基因产生了抑制作用。潘丽娟等[20]将控制花生蛋白质/油脂含量比例的关键酶——磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）的基因片段反向插入pCAMBIA1301-35S双元表达载体，构建了带PEPC反义基因的双元载体并进行花生的转化，获得转基因植株T1代种子。
刘强等[21]将在番茄心皮细胞分裂中起负调控作用并影响果重的重要数量性状基因fw2.2转化花生品种花育23号，获得了12个PCR阳性的独立转化子。半定量RT-PCR结果表明，该基因在花和叶片中的表达量较低，而在幼胚中的表达量较高，且在野生种A.stenasperma的表达量明显高于在栽培种鲁花11号。
邱金梅等[22]研究发现，以带子叶的胚轴为外植体，在OD600为0.7的菌液中，加入150 mg/L的表面活性剂（MES，methyl ester sulfonate），40 kPa真空处理10 min，共培养3 d后进行二次侵染，可显著提高遗传转化率，GUS基因阳性表达率最高，达73.3%。
高明等[23]以花生下胚轴为外植体转化花生品种四粒红，在含有0.8 mg/L除草剂Basta（主要成分是草丁膦）的培养基中获得67株抗性植株，经PCR检测，5株为阳性，bar试纸条检测至少有2株为阳性。
张廷婷等[24]利用基因芯片技术从抗、感黄曲霉花生品种中分离出差异表达基因PnLOX2，通过原核表达得到分子量为121.5 kD的融合表达产物，并构建了该基因的3′端反向重复结构，转化花生，得到了转基因花生苗，为反向鉴定PnLOX2基因在花生抗黄曲霉侵染过程中的功能奠定基础。陈湘瑜等[25]将拟南芥AtTTG1基因的编码区cDNA与“闽花6号”的花生果种皮特异启动子S19共同构建于带MAR序列的植物表达载体，旨在利用AtTTG1基因来改变花生果种皮抗黄曲霉这一物理屏障，增强花生抵抗黄曲霉侵染的能力。
Athmaram等[26]将BTVP2基因转入花生体细胞使其产生抑制病毒的蛋白——蓝舌病外衣壳蛋白。
姚庆收等[27]研究表明，以A600为0.8的发根农杆菌R1601菌液侵染花生叶片，在含50 μmol/L乙酰丁香酮的MS培养基培养时，可以高效地诱导得到花生毛状根。同时，任艳等[28]也指出，花生的叶片、子叶、下胚轴均能被发根农杆菌GIM1.141诱导出发根，相同诱导条件下，各外植体的发根诱导率为叶片>子叶>下胚轴；适宜的菌液浸泡时间为10 min；附加乙酰丁香酮（100 μmol/L），发根诱导率明显提高。
2.2 基因枪轰击、花粉管通道与直接转化法基因枪法本质上是一种物理过程，没有宿主限制，对单子叶和双子叶植物都能进行有效的转化。且不受组织类型限制，靶受体类型广泛，几乎所有具有潜在分生能力的组织或细胞都可以用其进行轰击转化。桂大萍等[29]以花生上胚轴为外植体，利用基因枪将含GUS基因的pCAMBIA2301质粒载体轰击体胚，外植体在添加5 mg/L毒莠定（Picloram）+1 mg/L谷氨酰胺（Glutamine）的MB培养基上诱导的体胚发生率、产胚数及植株再生率最高。不同基因型以中花8号体胚再生率最高（体胚诱导率为55.36%，植株再生率为56.79%）。在氦气压力为1 100 psi，轰击距离为9 cm时，体细胞胚B-葡糖苷酸（GUS）瞬时表达率可达22.95%。
花粉管通道法不需要组织培养，技术简单，基因型依赖性小，同时可以使用无标记的载体进行转化从而避免抗生素污染。范乾程等[30]利用花生Oleosin基因的启动子替换了pCAMBIA 1301的35S启动子，构建了重组表达载体pCAMBIA 1301-Oleosin-pro，通过花粉管通道法导入花生，PCR鉴定和GUS组织化学染色显示，50株转基因植株有9株能扩增出目的条带，阳性率为18%，高于之前报道的1%～10%；9株阳性转基因植株中有5株子叶能被GUS染色，表明Oleosin基因启动子驱动的GUS基因在油体蛋白中能够表达。王亚等[31]也通过花粉管通道法，将携带条斑紫菜PyTPS基因的pCAMBIA 2300-PyTPS重组载体导入花生，获得了T0转基因植株，PCR检测阳性率为34.7%；半定量RT-PCR分析与近红外技术证实条斑紫菜PyTPS基因导入花生后，既可提高转基因花生种子的耐盐性，又对部分后代种子的品质性状产生影响。
申红芸等[32]利用下胚轴纵切转化法，建立了利用发根农杆菌介导花生下胚轴形成转基因毛根和根瘤的新方法。花生下胚轴接种部位都有愈伤组织及毛根凸起形成，诱导率100%；毛根生长约20 d，其长度可达到10 cm以上，此时去除花生主根，毛根迅速生长，多级侧根大量形成，同时有根瘤形成，说明该方法可以高效地转化发根农杆菌进入并整合到花生基因组中，进而诱导花生产生大量的毛根，是一个高效的转化方法。并分别用GFP和GUS 2种检测方法对该转化体系进行了检测，证明利用该转化体系可以获得阳性的转基因毛根和根瘤。该体系中，除前期农杆菌的培养在无菌条件下进行外，后续所有试验在普通实验室条件下即可进行，操作简单，是一个易于掌握而且高效的研究体系。
3 问题与展望
近10年来，花生基因工程研究取得突破性进展，已建立了花生转化和再生体系，但存在基因型差异大、再生率低、生长慢等问题，建立高效稳定的花生遗传转化和再生体系仍然十分必要。需要加强建立不同基因型花生高效植株再生体系，提高体细胞胚的诱导效率，利用组织培养与化学诱变筛选各种不同抗性材料，农杆菌转化体系获得到稳定表达的转基因植株，通过遗传转化创新种质资源及其应用等问题的研究。此外，国内研究多使用2，4-D、ZT和6-BA等激素来诱导花生不定芽和体细胞胚，TDZ作为一种新型高效的植物生长调节剂，已受到越来越多研究者的关注，TDZ在花生遗传转化和再生体系中的作用亦有待于进一步研究。
参考文献
[1] 池慧芳.豆科植物组织培养研究进展[J].内蒙古农业科技，2014（3）：15-16.
[2] 苗利娟，张新友，黄冰艳，等.不同花生品种幼叶丛生芽诱导研究[J].河南农业科学，2012，41（11）：45-48.
[3] 黄玲，岳增辉，缪蕾，等.花生不定芽分化及植株再生的研究[J].中国农学通报，2013，29（33）：291-295.
[4] 隋炯明，乔利仙，赵明霞，等.不同基因型对花生胚小叶植株再生的影响[J].中国农学通报，2012，28（27）：45-48.
[5] 马彩霞，穆国俊，侯名语，等.一种快速、高效花生植株再生体系的建立[J].植物生理学报，2013，49（12）：1333-1338.
[6] 尤淑丽.花生高效再生体系的建立初报[J].黑龙江农业科学，2014（3）：13-15.
[7] 徐娟，张廷婷，张甲佳，等.不同花生品种再生体系的建立[J].山东农业科学，2014，46（6）：23-26.
[8] 赵明霞，隋炯明，王晓杰，等.平阳霉素对花生体细胞胚胎发生的影响[J].核农学报，2011，25（2）：242-246.
[9] 王莉莉，赵明霞，乔利仙，等.快中子辐照对花生胚小叶体细胞胚胎发生的影响[J].核农学报，2011，25（4）：652-656.
[10] 刘艳芝，韦正乙，谭化，等.花生体细胞胚发生及植株再生[J].吉林农业科学，2008，33（4）：7-10.
[11] 蒋菁，唐秀梅，熊发前，等.花生体细胞胚诱导及植株再生研究[J].中国农学通报，2012，28（3）：138-142.
[12] 戴梓茹，黎继烈，林美芳.激素对花生根愈伤组织诱导的影响[J].南方农业学报，2013，44（2）：200-204.
[13]徐晓峰，黄学林.TDZ：一种有效的植物生长调节剂[J].植物学通报，2003，20（2）：227-237.
[14] ABBASI B H，ZEB A.Thidiazuron：A multi-dimensional plant growth regulator[J].Afican Journal of Biotechnology，2011，10（45）：8984-9000.
[15] HUETTEMAN C A，PREECE J E.Thidiazuron：a potent cytokinin for woody plant tissue culture[J].Plant Cell Tiss Organ Cult，1993，33：105-119.
[16] 张月婷，桂大萍，叶小文，等.TDZ在花生离体扩繁中的应用研究[J].江苏农业科学，2011（1）：65-68.
[17] EAPEN S，GEORGE L.Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer in Peanut（Arachis hypogaea L.）[J].Plant Cell Reports，1994，13：582-586.
[18] 石新国，陈华，陈湘瑜，等.FAD2和γ-TMT基因双价种子特异表达载体的构建及对花生的转化[J].中国油料作物学报，2010，32（2）：202-207.
[19] 殷冬梅，杨海棠，台国琴，等.花生油酸脱氢酶基因遗传转化体系的建立与表达分析[J].中国农业科学，2009，42（5）：1827-1832.
[20] 潘丽娟，迟晓元，陈娜，等.花生PEPC基因反义表达载体构建及对花生的遗传转化[J].花生学报，2013，42（2）：9-13.
[21] 刘强，王晶珊，乔利仙，等.花生fw2.2基因的克隆及遗传转化[J].核农学报，2011，25（6）：1123-1128，1210.
[22] 邱金梅，温世杰，刘海燕，等.根癌农杆菌介导花生高效遗传转化体系的优化[J].中国油料作物学报，2010，32（2）：208-211.
[23] 高明，谭化，王云鹏，等.根癌农杆菌介导花生遗传转化体系的建立[J].吉林农业科学，2013，38（3）：35-38.
[24] 张廷婷，马登超，宫清轩，等.花生抗黄曲霉相关基因PnLOX2的原核表达及RNAi载体的构建与转化[J].山东农业科学，2014，46（9）：1-7.
[25] 陈湘瑜，郑国栋，黄金堂，等.拟南芥AtTTG1基因的克隆及用于转化花生的MAR调控表达载体构建[J].花生学报，2014，43（2）：1-6.
[26] ATHMARAM T N，BALI G，DEVAIAH K M.Integration and expression of bluetongue VP2 gene insomatic embryos of peanut through particle bombardment method[J].Vaccine，2006，15：2994-3000.
[27] 姚庆收，姜吉刚，单长民，等.花生毛状根的高频诱导及NAA和2，4-D对花生毛状根生长和白藜芦醇含量的影响[J].药物生物技术，2012（6）：507-511.
[28] 任艳，李磊，崔潇，等.发根农杆菌诱导花生发根的条件优化[J].核农学报，2012（3）：439-443.
[29] 桂大萍，张月婷，文奇根，等.花生体胚诱导再生体系及基因枪转化条件的初步探讨[J].西北植物学报，2010，30（10）：1966-1970.
[30] 范乾程，谭玲玲，王亚，等.花粉管通道法验证花生Oleosin基因启动子的特异性表达[J].中国粮油学报，2013，28（12）：52-56.
[31]王亚，郭宝太，乔利仙，等.PyTPS转化花生对其后代耐盐性和品质性状的影响[J].华北农学报，2014，29（5）：175-179.
[32] 申红芸，熊宏春，郭笑彤，等.一种发根农杆菌介导的花生遗传转化新方法[J].植物营养与肥料学报，2012，18（2）：518-522.
责任编辑 李占东 责任校对 李岩
相关热词搜索： 研究进展 遗传 花生 转化 培养
