材料与方法
１．１材料
１．１．１检测对象采样地点为长沙市两个屠宰场及两个动物医院。采用随机方式抽取健康成年猪４１头，待检猪观察无腹泻、便秘、厌食等异常现象，近期（包括观察期）未使用抗生素，常规饲喂。检测取样前４ｈ禁食。
１．１．２主要仪器与试剂恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，无菌工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，微量移液枪等；各种培养基（各培养基按常规方法配制）。以上仪器及试剂均由湖南农业大学传染病实验室提供。
１．２方法
１．２．１采样培养用无菌的药棉擦拭呼吸道、消化道取菌。用无菌生理盐水浸泡无菌棉拭子后，进入猪直肠２～３ｃｍ或鼻腔、喉头，取菌后立即分区划线接种于平板，３７℃条件下培养１８～２４ｈ。
１．２．２细菌培养物的分离培养用水溶液稀释，涂布法培养，显微镜观察。挑取不同菌落革兰氏染色后显微镜下观察，然后再做基本的生化试验。同时，从琼脂平板上挑取单个菌落，接种到标准ＬＢ培养基或加血清的ＬＢ培养基中，生长到对数末期，然后从中提取质粒。
１．２．３生化试验进行乳糖、麦芽糖、甘露醇、葡萄糖、蔗糖发酵，硫化氢试验、尿素试验、枸橼酸钠试验、蛋白胨水试验、硝酸盐还原、液化明胶、ＶＰ试验。
通过菌落形态观察、革兰氏染色镜检及生化试验进行初步鉴定及分类。
１．２．４细菌质粒提取挑单个菌落，接种于０．７５ｍＬ ＬＢ培养基中，３７℃培养过夜。１０ ０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｓ，弃上清；加入２００μＬ ＴＥ（含０．３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＡｃ）重悬，再加２００μＬ ＴＥ保护酚振荡裂解；１２ ０００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ；取上清，加２倍体积无水乙醇；１２ ０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ；弃上清，沉淀用７５％酒精洗涤，晾干；２０～５０μＬ ＴＥ悬浮沉淀，用５μＬ电泳鉴定［２］。
２结果
２．１细菌染色、培养及生化试验结果
结合细菌染色、培养特点及生化试验结果，根据《伯杰细菌手册》分析结果如下：试验共分离了６６株菌株，编号为ｈｈ１－ｈｈ６６，其中ｈｈ２６、ｈｈ３０、ｈｈ３１、ｈｈ３２、ｈｈ３５、ｈｈ３８、ｈｈ３９为双歧杆菌属，ｈｈ８、ｈｈ１５、ｈｈ１７、ｈｈ２０、ｈｈ２９、ｈｈ４３为乳酸杆菌属，ｈｈ１、ｈｈ２、ｈｈ６为志贺氏菌属，ｈｈ３、ｈｈ２３、ｈｈ３７、ｈｈ６１、ｈｈ６３为肠球菌属，ｈｈ４、ｈｈ５、ｈｈ７、ｈｈ１１、ｈｈ２７、ｈｈ２８、ｈｈ３３、ｈｈ４４、ｈｈ４８、ｈｈ５２、ｈｈ５３为埃希氏菌属，ｈｈ１２、ｈｈ１３为克雷伯氏菌属，ｈｈ１０、ｈｈ１８为肠细胞菌属，ｈｈ５５、ｈｈ５９、ｈｈ６０为白假丝酵母，ｈｈ６４为奈氏菌属，ｈｈ１９、ｈｈ５４、ｈｈ６６为变形菌属，ｈｈ２２、ｈｈ５０、ｈｈ５１为丁酸梭菌属，ｈｈ９、ｈｈ１４、ｈｈ１６、ｈｈ１９、ｈｈ２１、ｈｈ２４、ｈｈ２５、ｈｈ４０、ｈｈ４１、ｈｈ４２、ｈｈ４７为丙酸梭菌属，ｈｈ４５为链球菌属。另有８株菌株无法判断，可能是因为细菌的易变异性与质粒的数量可变性，以及操作者在操作过程中人为因素的影响，导致结果的不确定性。
２．２质粒电泳结果
根据电泳结果（图１－３）得出：有２３株菌株有５条带（亮），有１２株菌株有５条带（不亮），有１４株菌株无条带，有８株菌株有２条带，有１１株菌株有４条带。通过细菌质粒提取，进一步分类鉴定此次检测的猪的消化道、呼吸道有６６株菌株，分别是双歧杆菌、乳酸杆菌、志贺氏菌、肠球菌、埃希氏菌、克雷伯氏菌、肠细胞菌、白假丝酵母菌、奈氏菌、变形菌、丁酸梭菌、丙酸梭菌、链球菌等１０多种菌类。
２．３细菌中质粒的存在
细菌作为一种古老的生物，在地球上存在的年代远远长于人类，由于抗生素及其他药物的应用，细菌为了适应环境免遭伤害形成了多种防卫机制，由此产生的耐药菌得以存活和繁殖［３］。从试验中得出细菌所含质粒丰富，在６６株菌株中有质粒的有５２株，占７８．８％，只有２１．２％的细菌无质粒（亦可能质粒丢失）。而质粒上有耐药基因，它的存在与细菌的耐药性有密切的联系，目前细菌耐药和多重耐药成为全球关注的问题，提取其耐药基因，掌握细菌对药物的耐药机制才能在临床工作中制定出正确的给药方案［４］。本次试验通过细菌质粒提取，并对其进行分类鉴定，为后续对质粒上相关基因的提取及其作用机制的研究奠定基础，并为指导临床实践提供了依据。
３讨论与小结
３．１正常菌群的生物学作用
３．１．１营养作用消化道正常菌群不仅从宿主消化道获取营养，同时通过帮助消化、合成维生素等对宿主起营养作用。如肠球菌可将蛋白质分解为氨基酸；双歧杆菌能产生各种酶，将不溶性蛋白、脂肪和糖等变为可溶性。
３．１．２免疫作用正常微生物群中各种类型的细菌均为特异性抗原，能刺激机体产生相应的天然抗体。
３．１．３拮抗作用正常菌群对包括致病菌在内的外在菌入侵动物机体有一定程度的拮抗作用。
３．１．４屏障防御正常菌群是阻止致病菌入侵的生物屏障基础，并与免疫系统一起执行肠道的防御功能［５］。
３．２微生物群质粒的耐药基因
人和动物体内存在大量的正常微生物，构成相应的微生态区系，是其生命不可或缺的一部分。这些微生物尤其是动物体正常菌群，不仅对宿主具有防御、营养、免疫等重要生理作用，还参与机会感染等病理过程，是人和动物诸多生理病理现象的重要参与因素［６］。
在生产实践中，由于抗生素及其他药物的滥用（如低剂量抗菌促生长剂的长期使用、盲目用药和超剂量使用等）［７］，进而形成更大选择压力，这使得抗菌药的使用效果变得越来越差，导致正常菌群耐药性的广泛产生，使猪体内环境的相对平衡被打破。而细菌抗药性的流行与耐药质粒的转移有很大关系，由耐药性质粒介导的耐药菌在世界范围内急剧增加，而且还朝着介导多重耐药的方向发展［８］。虽然通过改善养殖条件及使用针对性的疫苗可以减少细菌性疾病的发生，但最主要的防治措施仍然是使用抗菌剂药物。
目前，在常规药敏试验的基础上，各国研究者利用分子生物学技术对细菌耐药性的分子流行病学做了大量的研究，进行耐药基因的检测及定位、转移和传播规律、片段多态性、序列同源性等分析，以期从分子水平上掌握耐药基因的遗传机制，为监测和控制细菌的耐药性奠定理论基础［９］。了解健康猪呼吸道、消化道正常菌群的质粒分布情况，可为进一步提取正常菌群中质粒的耐药基因和毒力基因打下基础，为制定用药规范、消除细菌耐药性以及降低其耐药性的扩散等提供科学依据，对保证我国畜禽养殖业的健康发展和人类健康有重要意义。
参考文献：
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［２］中国畜牧兽医学会动物微生态学分会．动物微生态研究进展［Ｍ］．北京：北京农业大学出版社，２０００．２４－４３．
［３］张晓梅，王家平，糜祖皇．８０株大肠埃希菌耐药性及氨基糖苷类修饰酶基因分析［Ｊ］．江苏大学学报（医学版），２００６，１６（３）：２４６－２４７．
［４］张德福，刘东．国内外小型猪实验动物化研究［Ｊ］．微生物学通报，２００４，３９（１０）：１４－１６．
［５］田维毅，王文佳，李海峰，等．贵州小型猪胃肠道正常菌群的初步检测［Ｊ］．四川动物，２００８，２７（１）：１４５－１４６，１５２．
［７］宋玮，唐英春，陆坚，等．产质粒介导ＡｍｐＣ酶细菌的耐药性及分子流行病学研究［Ｊ］．中国抗感染化疗杂志，２００４，４（２）：７０－７４．
［８］康白．微生态学原理［Ｍ］．大连：大连出版社，２００２．４２－９９．
［９］王琴，杨萍，胡静仪，等．６０株肺炎克雷伯菌多重耐药性及主要耐药基因的研究［Ｊ］．天津医药，２００５，３３（６）：３３８－３４１．
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