摘 要：采用肌注的方式，给药浓度10mg/kg，并采用液相色谱荧光法检测，初步研究了恩诺沙星在乌鳢体内的代谢规律及代谢产物环丙沙星的消除规律。实验结果表明：恩诺沙星及环丙沙星在血浆样品中的回收率为88.5%～91.3%，在肾、脾、肝、肌肉组织样品中的回收率为82.1%～87.6%。恩诺沙星、环丙沙星的最低检测限均可达到0.01mg/kg。恩诺沙星在乌鳢体内肌注给药后，血样中浓度快速升高，2h左右基本达到顶峰，然后再缓慢降低；在肾、脾、肝组织中，9～12 h浓度达到顶峰，其中依次为肾>脾>肝，5d后还有2～4mg/kg的残留；肌肉组织中较其他组织浓度升高稍缓，在18～24h达到顶峰，但是在29d还有浓度0.05mg/kg左右残留。肌注给药后0.5h在样品血浆中、2h在肌肉组织中就能检出其代谢产物环丙沙星，且环丙沙星的浓度在血浆中24h内在0.1～0.4mg/kg范围内波动；而在代谢组织肾、脾、肝中环丙沙星浓度慢慢增加，在12h达到峰值，5d内浓度明显，29d检测不出；肌肉组织则浓度慢慢增加，5d达到实验最高浓度0.36mg/kg，29d时检测不出。
关键词：乌鳢；恩诺沙星；环丙沙星；代谢
中图分类号 S9 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）23-15-02
恩诺沙星（eofloxacin，ENR）为第三代喹诺酮类药物，是动物专用抗菌药，广泛应用于各种动物感染性疾病的预防和治疗。恩诺沙星在许多动物体内发生脱乙基反应代谢生成具有活性作用的环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）。恩诺沙星的原药及其代谢产物环丙沙星在动物体内共同作用，这也是此药效果优于其他同类药物的最主要的原因之一。但是在《无公害食品渔用药物使用准则》中已将环丙沙星明确规定为禁用渔药[1]。因此，了解恩诺沙星的代谢规律及其代谢产物环丙沙星的消除规律同样重要。目前关于恩诺沙星作用于水产养殖动物药代动力学方面的研究较多，如拟穴青蟹[2]、罗氏沼虾[3]、欧洲鳗鲡[4]、鲤鱼[5]、杂交鲟[6]等，但尚未见关于乌鳢体内恩诺沙星代谢规律及其代谢产物环丙沙星的消除规律的报道。本实验中建立了恩诺沙星及环丙沙星在乌鳢体内的检测方法，同时研究了恩诺沙星在乌鳢体内的代谢规律及其代谢产物环丙沙星的消除规律，以期为检测恩诺沙星及环丙沙星在水产动物体内的残留及在养殖中的合理使用提供参考资料。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验鱼 实验用乌鳢来自本单位水产研究所自繁自养的杂交鳢，体重250～300g，实验前一星期暂养在实验室玻璃缸中。
1.1.2 仪器设备 Waters e2695高效液相色谱仪（2475荧光检测器，美国Waters公司）；分散机（IKA T18）；氮吹仪（Organomation N-EVAP- 24）；旋涡混合器（VORTEX Wizard）；Milli-Q纯水系统（美国Millipor公司）。
1.1.3 药品与试剂 甲醇、乙腈为HPLC级。磷酸二氢钠、氢氧化钠、磷酸、三乙胺均为分析纯。恩诺沙星、盐酸环丙沙星标准品（德国Dr·Ehrenstorfer公司，纯度>98%）。
酸化乙腈：乙腈：（盐酸+水=1+1）=500∶4；磷酸盐缓冲液：0.1mol/L NaH2PO4，用5mol/L氢氧化钠溶液调pH至7.0；0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液：取磷酸3.4mL，加水至1 000mL。用三乙胺调pH至2.4；固相萃取小柱：Waters Oasis HLB 3mL/60mg。
1.2 方法
1.2.1 给药方式及取样 实验条件下暂养的健康杂交鳢，随机分组，每组5尾，留取未给药的作为空白对照。实验组每尾一次性肌注恩诺沙星10mg/kg体重，分别于给药后0.5h、1h、2h、4h、6h、9h、12h、18h、24h、5d、29d由心脏取血，肝素抗凝，3 000r×15min离心分离血浆，同时取肌肉、肾、肝脏组织，所有样品保存于-18℃待测。
1.2.2 样品处理
1.2.2.1 血浆样品 从冰箱中取出血浆样品，恢复至液态，准确称取2g样品，加6mL磷酸缓冲液，漩涡混匀，过HLB固相萃取小柱（预先用3mL甲醇活化、5mL水洗）、5mL水洗柱，2mL流动相洗脱（药物浓度高的血清样用5mL流动相洗脱），过0.45μm滤膜，上机测定。
1.2.2.2 肝、肾、肌肉样品 称取1～5g肝、肾、肌肉样品，加入15mL酸化乙腈，分散机匀浆1min，加2倍样品质量的无水硫酸钠，漩涡提取，离心，取上清液。残渣再用10mL酸化乙腈提取1次。合并上清液，35℃氮气吹干。准确加入 2.0mL流动相溶解，再分别用5mL正己烷净化2～3次，下层溶液过0.45μm滤膜，上机测定。
1.2.3 色谱条件及工作曲线 色谱柱：Aglient TC-C18，5μm，4.6mm×250mm；流动相：0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液（pH=2.4）：乙腈=85∶15；柱温：35℃；检测波长：λex 280nm，λem 450nm；流速：0.8mL/min
工作曲线：取一系列标准混合溶液，在上述色谱条件下检测药物含量，作出标准曲线。
2 结果与分析
2.1 检测方法结果
2.1.1 实验条件下，恩诺沙星与环丙沙星的保留时间分别为15.8min、22.1min左右，杂峰和药物峰分离良好。见图1空白基质加标样。
2.1.2 线性、回收率、精密度 在0～5μg/mL范围内线性关系良好，恩诺沙星和环丙沙星的标准曲线回归方程分别为（Y药物浓度，X峰面积）恩诺沙星：Y=1.228 1×104 X -2.337 5×104，相关系数r=0.999；环丙沙星Y= Y=2.201 0×104 X-4.850 9×104；相关系数r=0.999 5。
基质添加浓度恩诺沙星与环丙沙星均为0.1mg/kg，血浆样品的平均回收率为89.7%。其他组织中回收率为82.1%～87.6%。
2.2 恩诺沙星的代谢 恩诺沙星在乌鳢体内肌注给药后，血样中浓度快速升高，2h左右基本达到顶峰7.5mg/kg左右，然后再缓慢降低，18h还有5.1mg/kg左右，到5d仅有0.2mg/kg。在组织代谢中，肾、脾、肝在9～12h浓度达到顶峰，其中浓度肾>脾>肝，代谢到5d时还有2～4mg/kg的残留，直到29d组织中浓度才<0.1mg/kg。肌肉组织中，开始0.5h浓度较低，然后较其他组织浓度升高稍缓，在18～24h达到顶峰，但是在29d还有浓度0.05mg/kg左右残留。
2.3 环丙沙星消除 恩诺沙星在乌鳢体内肌注给药后0.5h就在样品血浆中检出其代谢产物环丙沙星，且环丙沙星的浓度24h内在0.1～0.4mg/kg范围内波动，在2h、6h分别呈现波峰。而代谢组织肾、脾、肝中环丙沙星浓度慢慢增加，在12h达到峰值，5d内浓度明显，29d检测不出。肌肉组织中从2h开始有低浓度环丙沙星检出，然后浓度慢慢增加，5d达到实验最高浓度0.36mg/kg，29d时检测不出。
3 讨论
乌鳢一次性肌注给药10mg/kg后，恩诺沙星在乌鳢体内吸收快，血药浓度高，维持时间长，在24h内维持一个较高的浓度水平。因此在实际生产过程中，如果必须用药，用药间隔24h都能起到良好的抑菌效果。
恩诺沙星在乌鳢组织代谢中，肾和脾的顶峰浓度都有高于给药浓度10mg/kg的情况，表明恩诺沙星主要在这两个组织中代谢且组织有富集药物的情况。
实验结果表明，恩诺沙星在乌鳢体内消除缓慢（尤其是相对低温条件下，本次试验是在9～10月份进行，气温偏低），29d还未能消除完全。生产中如果用药，为了安全，休药期至少1个月。环丙沙星的检出及消除规律表明恩诺沙星在乌鳢体内可以脱去乙基产生活性代谢物环丙沙星，但代谢率相对较低。环丙沙星的消除呈不规则波动，可能原因是：（1）实验中采样时间间隔设计不够细；（2）恩诺沙星在乌鳢体内会不断地代谢为环丙沙星，同时环丙沙星在不断地进行自身的代谢，鱼组织肌肉中环丙沙星含量是恩诺沙星代谢和环丙沙星自身代谢的一个平衡[7]。另外本次实验未考虑温度等环境因素及给药方式对恩诺沙星在乌鳢体内的代谢的影响，这些有待于进一步研究。
参考文献
[1]刘开永，汪开毓.恩诺沙星在水产中的应用与研究[J].中国兽药杂志，2004，38（10）：32-34.
[2]周帅，胡琳琳，房文红，等.恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星在拟穴青蟹体内的药代动力学[J].水产学报，2011，35（8）：1 182-1 188.
[3]钱云云，唐俊，郑宗林，等.恩诺沙星在罗氏沼虾体内的药物代谢动力学[J].动物学杂志，2007，42（5）：62-69
[4]房文红，于慧娟，蔡友琼，等.恩诺沙星及其代谢物环丙沙星在欧洲鳗鲡体内的代谢动力学[J].中国水产科学，2007，14（4）：622-629
[5]张雅斌，刘艳辉，张祚新，等.恩诺沙星在鲤体内的药效学及药动力学研究[J].大连水产学院学报，2004，19（4）：239-242.
[6]郭娇娇，潘红艳，杨虎，等.恩诺沙星在杂交鲟体内的药物代谢动力学[J].大连海洋大学学报，2011，26（4）：362-366.
[7]徐维海，林黎明，朱校斌.恩诺沙星及其代谢产物在吉富罗非鱼、中国对虾体内的残留规律研究[J].水产科学，2004，23（7）：5-8.
（责编：陶学军）
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