低温海水硝化细菌富集培养过程及影响因素

摘 要：多数硝化细菌的适宜温度是28 ℃左右，低于15 ℃硝化活性会基本丧失。为解决这一问题，通过构建低温海水硝化细菌富集培养装置，在11～14 ℃、pH值7.0～7.8、溶解氧4.0～4.5 mg/L条件下，经过150 d富集培养得到AOB硝化强度为21 mg（NH3-N）/（L·d），NOB硝化强度为93 mg（NO-2-N）/（L·d）的富集培养物。对富集培养物研究表明，当温度为15 ℃时，pH值为8.0、初始氨氮浓度为30 mg/L条件下氨氧化活性较强；当温度为15 ℃时，pH值为7.0、初始亚硝氮浓度为80 mg/L的条件下亚硝酸盐氧化活性较强。

关键词：硝化细菌；低温富集培养；pH；底物浓度

硝化细菌为化能自养，生长缓慢，对环境因素变化敏感[1-2]。其中温度对硝化细菌的活性影响较为明显，多数硝化细菌的适宜温度为28 ℃左右，当温度低于15 ℃时硝化作用急剧下降甚至停止[3]。在冬季海水养殖中，多数硝化细菌无法耐受其低溫环境，活性被极大抑制，对养殖状况不利[4]。自然界中耐低温的硝化细菌数量和种类较少，因此低温海水环境中硝化细菌的驯化和富集培养显得尤为重要。

目前，对于硝化细菌的富集培养、分离纯化与筛选方面的特性研究与应用较为广泛[5-6]，其中也不乏对低温环境硝化细菌富集、筛选与多样性方面的研究[7-9]，然而目前大多是针对淡水低温环境硝化细菌的富集培养，对海水低温条件下的应用实践（如工厂化冷水鱼养殖系统）可能效果甚微。因此，本研究构建一种低温海水型硝化细菌富集培养方法，研究了低温海水环境中不同条件对硝化细菌活性的影响，确定其适宜的生长环境，同时探究了无机氮盐去除率与底物浓度的关系，为低温海水硝化细菌富集培养条件的优化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用海沙取自冬季青岛某海水浴场3～5 cm浅层海沙；氨氧化细菌（AOB）培养液由氯化铵（AR）、碳酸氢钠（AR）、人工海水配制而成；亚硝酸盐氧化细菌（NOB）培养液由亚硝酸钠（AR）、碳酸氢钠（AR）、人工海水配制而成。

1.2 试验方法

1.2.1 富集培养方法 培养装置见图1。海沙经适当处理后分别加入2个烧杯，烧杯有效体积为5 L，两烧杯内加入海沙体积各1 L。分别向烧杯中加入事先配好的人工海水各4 L，盐度为30‰。将烧杯置于水箱，水缸液面略低于烧杯液面，烧杯中配备搅拌和曝气装置。使用冷水循环机将水温控制在11～14 ℃，使用搅拌器进行充分混合，控制溶解氧含量在4.0～4.5 mg/L。定期加入碳酸氢钠溶液以调节pH。初期分别向AOB和NOB烧杯中加入氯化铵和亚硝酸钠，使培养基中氨氮和亚硝酸盐氮浓度达到10 mg/L。每隔24 h检测烧杯中氨氮和亚硝酸盐氮浓度，当浓度达到较低水平时分别补充至10 mg/L，当硝化速率提高时，分别将培养基中氨氮和亚硝氮浓度提高至30 mg/L和100 mg/L。培养过程中每隔24 h测定氨氮和亚硝酸盐氮浓度。

图1 培养装置示意图

1.2.2 影响因素研究方法 试验通过控制温度、DO等相同条件，选取pH与底物浓度作为环境变量以探究培养所得低温AOB和NOB菌种的适宜生长环境。

1.2.3 水质监测方法 氨氮和亚硝酸盐氮分别采用纳氏试剂分光光度法和N-（1-萘基）乙二胺光度法测定[10]；溶解氧使用哈希溶解氧仪（HACH-HQ30d）测定；pH使用哈希便携式pH计（HACH-HQ30d）测定。

2 过程与步骤

2.1.1 菌种富集与筛选分离 菌种富集过程在1.2.1的基础上进行，当富集培养物硝化强度达到一定水平不再升高时，将AOB和NOB培养基静置2 h后分别加入一定量硅藻土材料（主要成分为SiO2，孔隙度大、吸收性强、化学性质稳定、成本低廉）便于硝化细菌吸附。为筛选和纯化所得菌种，加入硅藻土一段时间后需再次将培养基静置沉淀并分离出海沙，然后再次向AOB和NOB培养基中各添加一定量硅藻土。

2.2.2 pH对硝化强度的影响 各取等量4份AOB和NOB培养液200 mL于8个500 mL摇瓶中（摇瓶经高温灭菌处理），在15 ℃、溶解氧45～5 mg/L、避光条件下，分别投加氯化铵和亚硝酸钠使氨氮和亚硝酸盐氮底物浓度为20 mg/L和40 mg/L，调节pH分别为6.5、7、7.5、8，每隔6 h检测氨氮和亚硝酸盐氮浓度，测定不同pH条件下氨氧化速率和亚硝酸盐氧化速率。

2.2.3 底物浓度对降解效率的影响 各取等量4份AOB和NOB培养液200 mL于8个500 mL摇瓶中（摇瓶经高温灭菌处理），在15 ℃、溶解氧4.5～5 mg/L、pH值7～7.5、避光条件下，分别投加氯化铵使初始氨氮浓度分别为10、20、30、40 mg/L，分别投加亚硝酸钠使亚硝酸盐氮初始浓度分别为40、80、120、160 mg/L，每隔6 h检测氨氮和亚硝酸盐氮浓度，确定不同底物浓度条件下氨氧化速率和亚硝酸盐氧化速率。

3 结果与分析

3.1 硝化细菌富集培养过程

AOB和NOB富集培养过程中硝化强度变化见图2、图3，可以看出，初期海沙中AOB和NOB硝化强度极低，富集培养10 d后，AOB硝化强度为1.5 mg（NH3-N）/（L·d），NOB为0.5 mg（NO-2-N）/（L·d），随后10～30 d，由于只添加无机氮盐，培养基中有机物含量较低使得异养菌数量减少，与此同时，以无机氮盐为主要营养来源的化能自养型AOB和NOB得以迅速繁殖，硝化强度得以提高，富集培养30 d时AOB为4 mg（NH3-N）/（L·d），NOB为4.5 mg（NO-2-N）/（L·d）。富集培养30～60 d时 ，由于海沙晶粒表面光滑少孔，对AOB和NOB的吸附能力有限，硝化细菌没有足够的附着场所进行生长繁殖和正常的生理活动，使得硝化强度在该段时间内趋于平缓。分别向AOB和NOB培养容器内各添加200 g硅藻土，由于硅藻土疏松多孔、比表面积大的特质使得游离的硝化细菌得以附着，硝化强度在60～90 d这段时间内有了明显升高，硝化强度AOB由5 mg（NH3-N）/（L·d）升高至13 mg（NH3-N）/（L·d），NOB由12 mg（NO-2-N）/（L·d）升高至39 mg（NO-2-N）/（L·d）。为分离纯化培养的硝化细菌，停止搅拌和曝气，将培养基静置一段时间后取走最初放入的海沙，此时，由于带走一部分海沙上附着的硝化细菌使得原先的硝化强度有了一定程度的减弱。AOB硝化强度在培养120 d时降至9 mg（NH3-N）/（L·d），NOB在培养110 d时降至29 mg（NO-2-N）/（L·d）。随后再次向培养容器中分别添加硅藻土200 g，硝化强度随之增强，AOB为21 mg（NH3-N）/（L·d），NOB为93 mg（NO-2-N）/（L·d）。经过150 d低温驯化后AOB平均硝化强度由1.5 mg（NH3-N）/（L·d）提升至21 mg（NH3-N）/（L·d），为培养初期的14倍，NOB平均硝化强度由0.5 mg（NO-2-N）/（L·d）提升至93 mg（NO-2-N）/（L·d），为培养初期的186倍。

图2 AOB富集培养过程中硝化强度变化

图3 NOB富集培养过程中硝化强度变化

3.2 pH对细菌硝化强度的影响

3.2.1 pH对AOB硝化强度的影响 pH对AOB的氨氮降解效果影响见图4。由图可以看出，对于AOB在pH为7.5到8.0范围内氨氮降解速率高于pH在6.5到7.0之间，且当pH为8.0时氨氧化活性最高，为0.677 mg（NH3-N）/（L·h）。分别为pH在6.5、7、7.5时的1.22、119和1.03倍。分析原因可能是水溶液中NH3-N与NH+4-N存在电离平衡，NH3-N是氨氧化细菌的真正硝化基质，升高一定的pH可增加溶液中NH3-N占比从而提高基质有效性，促进氨氧化反应的进行。

图4 pH对AOB硝化强度的影响

3.2.2 pH对NOB硝化强度的影响 pH对NOB的亚硝氮降解效果影响见图5。由图可以看出，对于NOB在pH为6.5到7.0范围内亚硝氮降解速率高于pH在7.5到8.0之间，且当pH为7.0时亚硝酸盐氧化活性最高，为1.33 mg（NO-2-N）/（L·h）。分别为pH在6.5、7.5、80时的1.04、1.07和1.24倍。分析原因可能是水溶液中HNO2-N与NO-2-N存在电离平衡，HNO2-N是亚硝酸盐氧化细菌的真正硝化基质，降低一定的pH可增加溶液中HNO2-N占比从而提高基质有效性，促进亚硝酸盐氧化反应的进行。

图5 pH对NOB硝化强度的影响

3.3 底物浓度对降解效果的影响

3.3.1 底物浓度对AOB氨氮去除效果的影响 试验结果见表1。由表可知，AOB富集培养物对于低浓度氨氮废水（10 mg/L和20 mg/L）去除效果较好，处理36 h后氨氮去除率达90%以上，而对较高浓度氨氮废水（30 mg/L和40 mg/L）去除效果较差。AOB对氨氮转化速率随底物浓度先升后降，在30 mg/L时速率达到峰值，为0.93 mg（NH3-N）/（L·h），是其余底物浓度转化速率的2.16、1.35和1.98倍。转化速率达到峰值后若底物浓度继续增加，速率下降程度明显，导致去除效果减弱。分析原因为，底物浓度过高产生的抑制作用和溶解氧条件的限制都会对AOB的生理活性造成负面影响，导致氨氮转化速率下降，降解效果减弱。

3.3.2 底物浓度对NOB亚硝氮去除效果的影响 试验结果见表2。由表可知，NOB富集培养物对于低浓度氨氮废水（40 mg/L和80 mg/L）去除效果较好，处理24 h后亚硝氮去除率达90%以上，而对较高浓度氨氮废水（80 mg/L和120 mg/L）去除效果较差。NOB对亚硝氮转化速率随底物浓度先升后降，在80 mg/L时速率达到峰值，为5.5 mg（NO-2-N）/（L·h），是其余底物浓度转化速率的1.51、1.86和2.78倍。转化速率达到峰值后若底物浓度继续增加，速率下降程度明显，导致去除效果减弱。分析原因与氨氮同理，底物浓度过高产生的抑制作用和溶解氧条件的限制都会对NOB的生理活性造成负面影响，导致氨氮转化速率下降，降解效果减弱，且底物抑制对转化速率影响程度更大。

3.3.3 无机氮浓度对硝化强度的影响 在底物浓度试验中，发现氨氮和亚硝氮浓度对AOB和NOB的硝化强度具有一定影响，结果见图6、图7。由图可知，随着无机氮盐浓度增大，AOB和NOB对氨氮和亚硝氮的降解速率均呈现先增大后减小的规律。分析原因，一方面当无机氮盐浓度较低时，由于缺乏营养和能量来源，AOB和NOB的生长和活性受到抑制，导致硝化强度较弱；另一方面，随着无机氮盐浓度的升高，AOB和NOB获得足够的营养来源，硝化强度随之增强。但当氨氮浓度超过30 mg/L、亚硝氮浓度超过80 mg/L时，由于底物对AOB和NOB活性的抑制使得硝化作用减弱，硝化强度随之降低。由此可得，当氨氮和亚硝氮浓度分别达到30 mg/L和80 mg/L时可使AOB和NOB硝化强度达到较高水平，为完善富集培养条件和获得更高效的硝化细菌提供了理论依据。

图6 不同氨氮浓度下AOB硝化强度变化规律

图7 不同亚硝氮浓度下NOB硝化强度变化规律

4 结论

经过长时间低温驯化，AOB平均硝化强度由1.5 mg（NH3-N）/（L·d）提升至21 mg（NH3-N）/（L·d），NOB平均硝化强度由0.5 mg（NO-2-N）/（L·d）提升至93 mg（NO-2-N）/（L·d），硝化细菌在低温环境中具有较高活性，添加人工载体（如硅藻土）可增加硝化细菌附着面积，提高了对氨氮和亚硝酸盐氮的转化效率。

通过控制温度、溶解氧以及光照条件等培养因素发现，AOB在pH为8.0、氨氮初始浓度为30 mg/L时硝化强度最高； NOB在pH为7.0、亚硝氮浓度为80 mg/L时硝化强度最高。

5 讨论

硝化作用是在一系列酶促反应下进行的，低温不仅影响细菌细胞膜流动性并且降低菌体内氧化酶活性，从而影响作用效果。本研究控制恒定低温环境，根据不同培养阶段硝化菌作用强度的变化相应增加无机氮盐浓度以此提高菌群活性，对硝化强度变化进行分析，结合条件因素对其生理活性的影响，表明培养所得AOB和NOB在11～14 ℃低温环境下仍具有较高生理活性，较之前相关研究在15～18 ℃时富集培养所得硝化菌种更具耐低温特性[11]，具有较高实际应用价值。试验发现NOB较AOB的生长具有滞后性且NOB往往晚于AOB进行硝化作用，可能由于NOB世代周期更长，对于环境因素要求较高且难以附着。有研究表明AOB繁殖一代需要6～8 h，而NOB繁殖一代需要16～18 h[12]，试验结果与该研究规律相似。然而NOB在适应当前环境，生长繁殖状态稳定后，其对亚硝酸盐降解效果明显高于AOB对氨的降解效果，具体原因需要进行更深层次方面的研究。研究pH对培养所得低温硝化细菌活性的影响，表明AOB较NOB适宜在更高pH环境中生长，分析原因可能为NOB对硝化反应中间产物对其生长环境适应性的改变以及NOB本身生理活动状态有关。此特征与杨红艳[13]报道的AOB和NOB在不同pH生长条件的适应性相似（AOB适应pH范围7.0～8.5，NOB适应pH范围6.5～7.5）。底物浓度对微生物活性的影响主要表现在对其酶促反应进程的正负相关性的影响，从研究结果可以看出，在底物浓度很低时，硝化反应速度随底物浓度的增加而加快，两者呈正比关系。随着底物浓度的升高，反应速度不再呈正比例加快，反应速度增加的幅度不断下降。在氨氮和亞硝氮浓度分别达到30 mg/L和80 mg/L时，AOB和NOB硝化强度达到峰值，如果继续加大底物浓度，反应速度不增反降，此时过高的底物浓度对硝化细菌作用产生抑制，说明硝化菌体内的氧化酶已被底物所饱和[14]，由此可知对于高浓度无机氮废水导致硝化菌作用强度的减弱与处理耗时的增加同样降低该环境下的去除率和降解效果。

目前对低温硝化细菌研究中的菌种大多来自冬季污水处理厂回流污泥，污泥中微生物数量和种类庞杂，有机物含量高，可能会对硝化菌的分离提纯和培养产生一定影响。本研究中硝化菌种来自冬季海洋环境，有机物含量少，培养过程中异养菌对硝化菌生长的抑制作用较小，具有一定先天环境条件优势，培养得到的硝化细菌具有较好的低温耐受特性和较高的硝化性能。然而本研究培养周期较长，如何短时间内获得高效耐低温硝化菌种也将成为后续研究工作的重点方向。

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