能力验证中金黄色葡萄球菌定量检验的实验过程及经验

总结讨论。

关键词：调料粉;金黄色葡萄球菌;能力验证

Abstract：Ability verification is an important means to strengthen laboratory quality management and examine laboratory inspection ability， which is of positive significance to promote laboratory quality management and inspection level. Based on the verification of the capability of quantitative detection of Staphylococcus aureus in seasoning powder participated in by our laboratory， this paper summarizes and discusses the experimental process and relevant experience.

Key words：Seasoning powder; Staphylococcus aureus; Capability verification

中图分类号：TS207.4

能力验证是为确保实验室维持较高的校准和检测水平而对其能力进行考核、监督和确认的一种验证活动。通过参加能力验证活动，能够不断完善实验室的管理制度，提高实验室检测人员的技术水平，从而获得更加准确的检测数据。2018年8月，敦煌市食品药品检验检测中心微生物实验室参加了由甘肃省业务主管部门组织的实验室能力验证活动，检验项目是“调料粉中金黄色葡萄球菌定量检验”。最终的验证结果为“满意”，但数据结果偏低。为分析数据偏低的原因，总结经验，现将实验过程进行回顾分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

（1）材料。调料粉基质1瓶（25.0 g，编码：CODE-10）、白色菌球1瓶（1粒装，编码：CODE-10），将两种样品均置于-20 ℃冷柜中暂存。

（2）仪器。BSC-1500ⅡA2-X生物安全柜：济南鑫贝西生物技术有限公司生产;BAJMIXYR400CC拍打式均质器，法国interscience生产;HWS-150B恒温恒湿培养箱：天津泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验前准备

（1）准备实验环境。①使用紫外线灯和移动臭氧消毒机对微生物实验室整体环境灭菌40 min。②对实验室洁净度进行监测，确保达到实验要求。③对相关仪器设备及试剂进行检查，确保正常使用。

（2）拟定实验计划。计划做8个稀释梯度

（10-1～10-8），每个梯度做4组平行。

（3）准备试剂及相关物品。磷酸盐缓冲液225 mL，BP平板（Φ9 cm）96个，9 mL磷酸盐稀释管8支，带滤膜均质袋1个，L型涂布棒若干。

1.3 实验过程

实验严格按照国家标准GB 4789.10-2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》进行，生物安全事项参考国家标准GB 19489-2008生物安全通用要求。操作步骤：①菌丸复苏。实验前将待检样品从-20 ℃冰柜中取出，置于室温复苏1 h。②样品前处理。在生物安全柜内将225 mL磷酸盐稀释液和菌球加入均质袋中，让菌球充分溶解，然后将调料粉全部加入均质袋中，在均质机上均质2 min充分混匀。③制作样品匀液。从过滤的菌液中准确吸取样液1 mL，分别制成10-1～10-8稀释度的样品匀液，每个稀释度均制作4组进行平行对照。④样品接种。用移液枪分别吸取0.3、0.3、0.4 mL各稀释度的样品匀液，加入相应的BP平板，用L型无菌涂布棒小心均匀地涂布整个平板，同时避免涂布到平板边缘。⑤培养过程。将涂布完成的BP平板置于37 ℃培养箱进行培养。培养时先静置1 h等待样品液完全吸收，然后翻转倒置培养，48 h后观察结果。

2 结果与分析

2.1 典型菌落计数和确认

从所有稀释度的BP平板中选择可疑典型菌落在适宜计数范围内的3个平板。选择计数，10-3稀释度的BP平板符合计数条件，其典型可疑菌落合計64个。从中挑选出5个典型菌落分别接种于BHI中培养24 h，然后再分别接种冻干兔血浆进行观察，同时在血平板和金黄色葡萄球菌显色培养基上划线培养24 h。兔血浆、血平板和金显观察情况表见表1。

根据国家标准GB 4789.10-2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》9.1项，本次实验中10-3稀释度平板上的典型菌落为64个。

（1）式（1）中，T-样品中金黄色葡萄球菌菌落数;

A-某一稀释度典型菌落的总数;B-某一稀释度鉴定为阳性的菌落数;C-某一稀释度用于鉴定试验的菌落数;d-稀释因子。

能力验证结果的最终通报数据范围：4.0×104～1.6×105 CFU·g-1，本实验室上报结果为5.1×104 CFU·g-1，验证结果满意，但数据偏低。

2.2 数据偏低的原因分析

组织实验人员对数据偏低的原因进行了认真查找和深入分析。认为造成数据偏低的原因可能有以下几个方面：①样液未充分混匀。样液均质的时间偏短，没有充分混匀。②实验前未校准移液枪。因移液枪使用时间较久，准确度可能下降。在实验前应再次进行校准，以保证取样量的准确。③平皿薄厚不均。生物安全柜表面水平度不够，制作的平皿会出现一边薄一边厚的现象，样液在平皿上会流向低的一边以致流入平皿边缘缝隙，影响计数。④培养基干燥程度不够。培养基是否干燥会直接影响样液吸收。因此，应等平皿充分干燥后再加入样液进行涂布，使样液快速吸收，避免流动。⑤培养基面积偏小。本实验中使用的是直径9 cm的平皿，涂布时很容易将样液涂布到平皿边缘缝隙中，从而影响计数。如果使用直径更大的平皿，这一问题则可能会得到妥善解决。

3 结语

参加实验室能力验证对于实验室的发展有着非常明显的促进作用。每个实验室都应当积极参加能力验证活动，以提升自身的质量管理和能力水平。对于食品中微生物检验的能力验证来说，往往是细节决定成败。因此，在开展实验前一定要认真制定实验计划，充分准备实验环境，提前验证所需试剂及仪器设备，预判实验各环节中可能出现的问题。只有不断总结经验，才能在每一次的能力验证中取得好的成绩。

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