CRISPR家上新了：第三款CRISPR基因剪刀来袭

基因剪刀三兄弟

正如前面所说，CRISPR家有兄弟仨——三款基因剪刀，而其中的首款明星产品就是三兄弟之老大——CRISPR-Cas9，一经推出就成为学界爆款“剪刀”。

此前，科学家们在实验室最常用的多功能基因组编辑工具就是CRISPR-Cas9，这是一种RNA 导向的核酸酶，可以切割DNA。

Cas9系统首先由美国加州大学伯克利分校Jennifer Doudna、瑞典于默奥大学Emmanuelle Charpentier和美国麻省理工学院- 哈佛大学博德研究所张锋等实验室在2012年和2013年报道。

这个C家老大有多火爆？

Cas9有效地实现了哺乳动物基因组的编辑，并带动了基因编辑领域的迅猛发展，将基因编辑技术成功拓展到基因转录表达调控、表观遗传修饰、全基因组功能筛选、碱基编辑、基因组成像和细胞谱系追踪等多种生物学应用。它能使基因组更有效地产生变化或突变，效率比既往基因编辑技术更高，让CRISPR成为“生物科学领域的游戏规则改变者”，现已发展成为该领域最炙手可热的研究工具之一。

而Cas9并非Cas蛋白家族中唯一一种RNA導向的核酸酶，除了它之外，研究人员还发现Cas12a和Cas12b也具备成为基因剪刀的潜力。

如今，Cas12a已被开发成基因组编辑工具，张锋等人在2015年发现并改造的Cas12a（又称为Cpf1）系统，能实现哺乳动物等多个物种的基因组编辑。

这个老二比老大还优秀

Cas12a相对于Cas9来说有一些优势：它比标准的Cas9要小，更容易进入组织和细胞;它剪切时离识别位点很远，让研究人员在编辑位置的选择上有了更多的选择。

于是，CRISPR基因剪刀的潜力者哥仨，就剩下Cas12b（又称为C2c1）还没被开发成功了！这种蛋白比Cas9或Cas12a更小，更容易通过病毒载体实现细胞间递送，所以很可能是更好的基因剪刀。

特异性

目标特异性是指基因剪刀只瞄准那些为它们设定的目标基因，更高的特异性意味着更高的精确性，这对一款功能强大的基因编辑工具来说非常重要。

张锋团队的研究

为啥把有可能最棒的小弟剩下了？

因为Cas12b有嗜高温的特性，很难开发成好用的基因编辑工具。Cas12b来自一种嗜酸耐热菌，作为DNA裂解酶，它的最佳活性“工作环境”需要高达48℃的温度。普通哺乳动物如果达到这种温度，恐怕就要高烧死了吧！但达不到温度要求，Cas12b的酶活性就不能发挥，会罢工喔！

张锋团队对Cas12b进行了研究，他们先在Cas12b蛋白家族中寻找到一种喜欢常温的成员，鉴定出在37℃时能保持核酸酶活性的BhCas12b。但实验发现，原始结构的野生型BhCas12b会切割双链DNA中的非靶标单链，且温度越低、错误越多，导致编辑效率较低。

为解决这一问题，张锋团队对Cas12b重新进行了设计，增强其在人体体温37℃下的活性。根据蛋白质晶体结构的线索，研究人员通过4个点位突变，让酶的活性点位更容易和DNA靶序列接近，得到重新设计的新款Cas12b。

与Cas9相比，重新设计的Cas12b在细胞培养实验中对靶序列具有更高的特异性。毕竟，脱靶效应是CRISPR技术最大的隐患之一：Cas9酶有时会在靶点以外的地方进行切割，而这种切割有可能引起癌症。

张锋团队在细胞培养实验中，针对多个基因的多个靶序列，考察了新款基因剪刀的编辑效率。实验结果显示，新款Cas12b的编辑效率与Cas9、Cas12a相当，甚至更高;而且新款Cas12b导致的错误插入缺失比常用的Cas9少得多，脱靶率显著降低。

李伟团队的研究

不过，张锋团队的这款Cas12b基因剪刀还不能算首发。

不久前的2018年11月27日，《细胞发现》（Cell Discovery）发表了中国科学院动物研究所研究员李伟团队的类似研究成果。该研究团队通过系统挖掘，成功地鉴定出若干能在人体生理温度工作的Cas12b（C2c1）酶。经过系统改造，有两种Cas12b 酶被成功开发成为哺乳动物基因组编辑工具，能够编辑人类细胞基因组并应用于制备动物疾病模型。他们开发的来自酸性脂环酸芽孢杆菌（AaCas12b）的Cas12b，可以在31℃～59 ℃温度范围内对哺乳动物基因组进行编辑。

那篇论文展示了该工具的三大优点：

一是Cas12b比应用最为广泛的SpCas9和Cas12a更小，因此更容易用于需要载体递送的临床基因治疗;

二是Cas12b能够在宽广的温度范围和pH范围保持高的酶活性，有望适用于具有不同生理温度的多个物种。同时与SpCas9相比，Cas12b核糖核酸酶（RNP）在人血浆中更稳定;三是Cas12b很难耐受向导RNA与靶DNA之间的碱基错配，因此比SpCas9和Cas12a/Cpf1的脱靶效应更小，这意味着它在进行基因组编辑时更加安全。

针对这项新技术，该研究团队已于论文发表一年前提交了专利申请，并已开始开发这项技术在基因治疗中的应用。

当然，就像当初Cas9那款基因剪刀的打磨不是一个团队完成的那样，想要将Cas12b改造成和Cas9一样应用广泛的工具，也还有很多工作要做。但第三个潜在基因组编辑系统的出现，显然将会带给研究人员更多选择。

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CRISPR 的专利大战

此前，CRISPR基因编辑技术已经因其巨大的商业价值引发了专利大战。其中最引人注目的是张锋所在的博德研究所和Jennifer Doudna所在的加州大学伯克利分校之间的专利之争，因为这两家机构的专利范围广，对CRISPR-Cas9的大多数商业应用至关重要。

加州大学伯克利分校提出的专利是不限于任何环境的CRISPR-Cas9系统，博德研究所的专利主要为真核生物环境中的CRISPR-Cas9系统。美国专利商标局专利审判和上诉委员会曾于2017年2月作出关键裁决：麻省理工学院和哈佛大学的博德研究所的专利，与加州大学伯克利分校的发现并不“冲突”，博德研究所可以保留其在真核生物中使用CRISPR-Cas9的专利。之后，加州大学伯克利分校提起上诉，2018年9月联邦巡回上诉法院维持判决，张锋所在机构继续占据上风。

值得一提的是，专利判决并不会影响CRISPRCas9技术在科研领域的应用。博德研究所方面称，全世界的科研人员可以用他们的技术进行学术研究，但是厂商必须付费使用。