材料与方法
1.1材料
1.1.1主要细胞、载体和细菌。RAW264.7细胞、HEK293T细胞、慢病毒过表达载体（穿梭载体）pCD513B-1、慢病毒包装辅助载体pGag/Pol、pRev和pVSV-G，均由西北农林科技大学靳亚平教授馈赠;pMD19-T载体，购自大连TaKaRa生物工程有限公司;大肠杆菌DH5α感受态细胞，购自北京天根生物技术有限公司。
1.1.2主要试剂。Total RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、PrimeSTARTM HS DNA Polymerase、PrimeScriptTM RT Reagent Kit和TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ等，购自大连TaKaRa生物工程有限公司;DMEM（高糖）培养液、Advanced DMEM培养液、Opti-MEM培养液和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）等，购自美国Invitrogen贸易有限公司;TurboFect转染试剂，购自加拿大Fermentas公司;ERO1α兔多克隆抗体，购自台湾Abnova生技股份有限公司;β-actin鼠单克隆抗体，购自天津三箭生物技术有限公司。
1.1.3主要仪器。Ti-E倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）;Tanon 5200全自动化学发光/荧光图像分析系统（上海天能科技有限公司）;5810R型冷冻高速离心机（Eppendorf公司）;Bio-Rad iQ5实时荧光定量PCR仪（美国伯乐公司）。
1.2方法
1.2.1引物设计与合成。根据NCBI中小鼠ERO1α基因序列（Accession No.AF144695.2），应用Primer 5.0软件设计ERO1α基因的特异性引物，用于CDS区的扩增，在引物5′端添加Xba I和BamH I酶切位点，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如下：上游引物5′-ATTCTAGAATGGGCCGCGCCTGGGG-3′（下划线为Xba I酶切位点），下游引物5′-TGGGATCCTCAGTGAACATTCTGTAACAAGTGCCTG-3′（下划线为BamH I酶切位点）。
1.2.2ERO1α基因扩增和重组慢病毒过表达载体的构建。利用Total RNA提取试剂盒提取RAW264.7细胞总RNA，分光光度计测定其浓度和纯度。通过逆转录试剂盒合成cDNA，利用PrimeSTAR HS DNA Polymerase 扩增ERO1α基因的CDS区，PCR反应条件为94 ℃预变性5 min;98 ℃变性10 s，57 ℃退火5 s，72 ℃延伸1.5 min，共计30个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物进行核酸凝胶电泳检测，利用胶回收试剂盒进行纯化回收。回收后的片段进行末端加A反应并与pMD19-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，37 ℃培养过夜并提取质粒，酶切鉴定并送上海生工生物工程有限公司测序。测序正确的片段与线性化的穿梭载体pCD513B-1连接，转化培养和提取质粒，酶切鉴定，并命名为pCD513B-ERO1α。
1.2.3ERO1α过表达慢病毒的包装。将生长对数期的HEK293T细胞，按照1 × 106个/mL接种于细胞培养瓶中，细胞贴壁生长密度为90%左右时进行质粒转染。取重组质粒pCD513B-ERO1α或空载体质粒pCD513B-1 3 μg以及包装质粒pGag/Pol、pRev和pVSV-G各1 μg加入到400 μL Opti-MEM培养基中，混匀，加入12 μL的TurboFect转染试剂，轻轻混匀。室温静置20 min后，将质粒混合液加入到HEK293T细胞中，继续培养16 h后，弃去培养瓶中的培养液，更换为含有2% FBS、0.01 mmol/L 胆固醇、0.01 mmol/L 蛋黄卵磷脂和1 × chemically defined lipid concentrate的4 mL Advanced DMEM培养液，重新将培养瓶放回培养箱[8]。培养48 h后，收集细胞上清液，1 500 r/min离心5 min，取上清浓缩病毒，将浓缩液-80 ℃冻存备用。
1.2.4ERO1α过表达慢病毒滴度测定。将细胞密度为5 × 103个/mL HEK293T细胞接种到96孔板中，当细胞贴壁后进行滴度测定。配制含有10% FBS和8 μg/mL polybrene（促进病毒吸附）的DMEM 培养液备用;将浓缩的病毒与DMEM 培养液混合，倍比稀释依次为101～106倍。棄去96孔板原培养液，各加入100 μL不同浓度的病毒液，每组5个重复，同时设置阴性对照组。继续培养8 h后，将病毒液弃去，加入正常含10% FBS的DMEM培养液，继续培养48 h后，荧光显微镜观察GFP阳性细胞数，根据所有孔中含GFP阳性细胞的最大稀释倍数来计算病毒滴度（TU/mL）。病毒滴度（TU/mL）=平均GFP阳性细胞数（C）× 稀释倍数（D）/接种病毒的体积（V）[9]。
1.2.5ERO1α慢病毒转导RAW264.7细胞及稳定表达筛选。将RAW264.7细胞按照1 × 105个/mL接种于6孔板中，细胞贴壁后进行病毒转导。配制含有10% FBS和8 μg/mL polybrene的DMEM培养液备用，将病毒（MOI =20）加入到已配制的DMEM培养液中，培养48 h后，观察荧光的表达;将转导后的细胞进行传代并更换含有5 μg/mL嘌呤霉素的DMEM培养液继续培养，3 d后观察细胞状态和荧光表达情况[10]。
1.2.6RT-qRCR检测ERO1α mRNA水平的表达。提取嘌呤霉素筛选后的RAW264.7细胞总RNA，进行浓度和纯度测定。根据PrimeScriptTM RT Reagent Kit的操作说明，将RNA反转录为cDNA待用。设计ERO1α和内参β-actin定量PCR引物，引物序列如下：ERO1α-QF：5′-CACTGGGAATAAAGTTCAGGATG-3′，ERO1α-QR：5′- CGGAAGTCCTCCTTTAGTTTATGT-3′;β-actin-QF：5′-GCAAGCAGGAACGATGAG-3′，β-actin-QR：5′-CCATGCCAATGTTGTCTCTT-3′。根据TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ的操作说明，在荧光定量PCR仪上对ERO1α进行定量检测，反应程序如下：95 ℃预变性30 s;定量分析，95 ℃变性5 s，60 ℃延伸20 s，共40个循环;溶解曲线，95 ℃5 s，60 ℃ 1 min。荧光定量结果采用2-△△Ct法进行分析。
1.2.7Western blot检测ERO1α蛋白水平的表达。提取嘌呤霉素筛选后的RAW264.7细胞总蛋白，进行浓度测定和蛋白变性。待测蛋白通过SDS-PAGE凝胶电泳分离，并利用湿转法将蛋白转移到PVDF膜上;10%的脱脂奶粉溶液封闭1 h;ERO1α和β-actin抗体分别按照1∶500和1∶1 000进行稀释，4 ℃孵育过夜;次日，1∶5 000稀释羊抗兔和羊抗鼠二抗孵育1 h;根据ECL发光液的操作说明，利用凝胶照相系统对蛋白进行曝光和照相并进行数据分析。
2结果与分析
2.1pCD513B-ERO1α慢病毒过表达载体的构建和鉴定根据ERO1α基因序列设计的引物，其扩增片段的大小为1 400 bp左右。由图1A可知，核酸凝胶电泳结果显示在1 000～2 000 bp出现特异性预期大小的条带。扩增片段亚克隆到pMD19-T载体上，构建pMD19-T-ERO1α重组载体。由图1B可知，核酸凝胶电泳结果显示pMD19-T-ERO1α酶切后在2 500 bp和1 000～2 500 bp出现特异性预期大小的条带。酶切正确的载体提取质粒并测序，测序正确的片段连接到pCD513B-1，构建pCD513B-ERO1α重组慢病毒过表达载体。由图1C可知，核酸凝胶电泳结果显示在7 500～10 000 bp 以及1 000～2 500 bp出现特异性预期大小的条带。
2.2pCD513B-ERO1α慢病毒包装和滴度测定将穿梭质粒pCD513B-ERO1α与辅助质粒pGag/Pol、pRev和pVSV-G共转染HEK293T细胞。由图2可知，转染48 h后HEK293T细胞可观察到大量GFP表达。将浓缩病毒倍比稀释分别转导HEK293T细胞进行病毒滴度的测定。由图3可知，101倍稀释组细胞表达GFP荧光较多，105倍稀释组可见零星GFP表达，而106倍稀释组未见GFP的表达，通过计算得出病毒滴度为5×106～10×106 TU/mL。
.3pCD513B-ERO1α慢病毒转导RAW264.7细胞及稳定表达筛选将浓缩的病毒（MOI = 20）转导RAW264.7细胞48 h后观察荧光表达情况。由图4A和B可知，80%以上的细胞能够观察到GFP表达。由图4C和D可知，在培养液中添加5 μg/mL嘌呤霉素，3 d后培养板中细胞变少，但全带有GFP。由图4E和F可知，筛选后的细胞再次传代后在荧光显微镜下观察到所有的细胞均带GFP。
2.4pCD513B-ERO1α过表达效果的测定嘌呤霉素筛选后的RAW264.7细胞提取mRNA和蛋白并进行RT-qPCR和Western blot过表达效果检测。由图5A可知，RT-qPCR结果显示，未处理Control组和pCD513B-1组相比无统计学差异，pCD513B-ERO1α组与Control组和pCD513B-1组相比，ERO1α的mRNA表达显著升高（P<0.001）。由图5B可知，Western blot结果显示，pCD513B-ERO1α组的ERO1α蛋白表达量显著高于Control组和pCD513B-1组。
3结论与讨论
ERO1α是内质网中的重要氧化还原酶，在内质网蛋白质折叠过程中，有助于分泌蛋白和膜蛋白二硫键的生成[1-3]。随着对ERO1α研究的不断深入，研究发现ERO1α对于肿瘤对机体免疫抑制和逃避起着非常重要的作用，且过表达ERO1α有助于肿瘤的生长以及肿瘤细胞的增殖[4-7]。为了进一步研究ERO1α对机体免疫调节的分子机制，成功构建了ERO1α重组慢病毒过表达载体pCD513B-ERO1α，且稳定转染RAW264.7细胞。
RAW264.7细胞来源于BALB/c小鼠，是一种永生化的巨噬细胞系，在研究免疫应答反应过程中起到非常重要的作用[11]。慢病毒转导RAW264.7细胞48 h后荧光显微镜下能够观察到较强的GFP表达。该试验采用的是第三代慢病毒载体，即四质粒系统，相比于第一代和二代慢病毒载体其生物安全性更高，病毒包装效率更高。与其他的载体系统相比，慢病毒载体能够携带较长的目的基因片段和稳定高效地转导细胞系或原代细胞，并且不会启动细胞的免疫应答机制[12]。慢病毒转导RAW264.7细胞后能够将携带的ERO1α基因插入到细胞自身基因组内并长期稳定表达，通过嘌呤霉素的筛选作用获得稳定表达ERO1α的细胞克隆。细胞克隆能够继续培养和传代，并保持对ERO1α的过表达效果。通过对转导后的RAW264.7细胞的检测，发现pCD513B-ERO1α重组慢病毒过表达载体能够显著增加ERO1α的过表达效果，证实该载体构建成功。
总之，该研究通过扩增ERO1α的CDS区并亚克隆到慢病毒载体pCD513B-1上，成功构建了pCD513B-ERO1α慢病毒过表达载体。通过转导RAW264.7细胞并进行抗性筛选，成功筛选到稳定表达ERO1α的RAW264.7细胞，为后续研究ERO1α的免疫调节作用提供了技术支持。
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