摘要
[目的]为了获得B.bipolaris HD1胆红素氧化酶纯品，确定酶的同源性及其常规酶学性质。[方法]将B.bipolaris HD1发酵液依次通过硫酸铵盐析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析确定蛋白的纯度、浓度和酶活力；通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDITOF）法获得氨基酸序列，并利用Mascot软件在NCBI蛋白库中的比对，以确定同源蛋白来源；用SDSPAGE方法测其表观分子量；用等电聚焦方法测定等电点；用LinwerverBurk双倒数作图法测定米氏常数；并对该酶的酶学性质进行了常规的测定。[结果]获得具有胆红素氧化酶酶活性的电泳纯单体蛋白，酶活为46 000 U/L，比活为1.15 U/mg；MALDITOF共获得135个氨基酸，该蛋白与来源于Helminthosporium triticivulgaris的漆酶前体蛋白序列同源性达100%；蛋白的表观分子量为68 kDa；pI为4.1；它对ABTS和胆红素的米氏常数分别为Km（ABTS）=1.8×10-5mol/L（pH 3.0）和Km（bilirubin）=2.7×10-5mol/L（pH 7.5）；对胆红素的最适催化活性为36 ℃，酶在-40 ℃下可保持2年，酶活保持在90%以上，在pH 8～9.5下可保持相当高的催化胆红素活性，能够耐受高浓度的硝酸钠和尿素，低浓度的叠氮化钠对酶活有促进作用而高浓度则抑制，对氯化钠、溶解氧敏感。[结论]该蛋白具有典型的胆红素氧化酶特性，又存在明显的不同。
关键词 胆红素氧化酶；Bipolaris australiensis；蛋白纯化；鉴定；酶学性质
中图分类号 S182 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03228-04
Abstract [Objective] The research aimed to obtain a high purity protein of BOD from B. bipolaris HD1， and determined its homology and the common properties. [Method] The supernatant of B. bipolaris HD1 broth was performed by ammonium sulfate salting out， DEAEsepharose fast flow anion exchange chromatography and SephadexG75 gel filtration chromatography respectively. The purity of this protein was determined by SDSPAGE. The specific activity was assayed in TrisHCl buffer at 37 ℃（pH 7.4）. The amino acid residues was determined by Matrixassisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry（MALDITOF）and the homology was obtained with software Mascot on the databank of NCBI. The molecular weight was determined by SDSPAGE. The pI was determined by means of isoelectric focusing. The kinetic parameters for this enzyme were determined by LinwerverBurk doublereciprocal plots. The common properties of BOD were assayed by conventional methods. [Result] A single band was obtained by SDSPAGE. The enzyme activity was 46 000 U/L. The specific activity was 1.15 U/mg. A 135 amino acid residue was obtained. There was a 100% homologous with a laccase precousors from Helminthosporium triticivulgaris. The molecular weight was 68 kDa. The pI was 4.1. The kinetic parameters for this enzyme were Km（ABTS）=1.8×10-5mol/L at pH 3.0 and Km（bilirubin）=2.7×10-5mol/L at pH 7.5 respectively. The common properties of this enzyme shown as： the enzyme had a optimum temperature to catalyze bilirubin to biliverdin at 36 ℃， it was stable at -40 ℃ or lower and keep activity up to 90% for two years， it could keep a high activity in range of pH from 8 to 9.5， the enzyme had activity in condition that higher concentration of sodium nitrate and urea， however， the enzyme was inhibited by high concentration of sodium azide， there was a contrary results at lower concentration. It was sensitive for sodium chloride and dissolved oxygen（DO）. [Conclusion] BOD from B. australiensis HD1 exhibited a typical characteristic of BODs， and at that time a significantly different existed.
Key words Bilirubin oxidase； Bipolaris australiensis；Protein purification；Identification； Enzymatic characteristic
胆红素氧化酶（Bilirubin oxidase，BOD，EC 1.3.3.5）是由日本学者[1]最早从丝状真菌（Myrothecium verrucaria）中分离并纯化出来，因其能催化胆红素氧化而得名。研究表明，它与漆酶一样同属多铜氧化酶（Multicopper oxidases，MCOs）家族，但与漆酶存在众多方面的异同，如能催化氧化胆红素，在生理条件下具有相对高的酶活性，对氯离子有高耐受性，对脲反应的特异性等，因而成为理想的制作生物传感器阴极材料[2-7]。为此，该酶成为目前该领域研究者最为热衷的研究对象之一。笔者从玉米叶片的病斑中分离得到一株具有较高BOD酶活的菌株，被鉴定为Bipolaris australiensis。为了在实践中能够充分利用该酶，笔者对源于Bipolaris australiensis BOD进行了纯化和酶学性质的研究，为该酶在应用中研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 硫酸铵盐析
盐析方法参照文献[8]。将发酵培养的菌悬液7 800 g离心30 min，去菌体，收集上清。在室温下缓缓加入硫酸铵粉末至饱和度为80%，将其置于4 ℃下，缓慢搅拌过夜，离心收集沉淀，用15 mmol/L TrisHCl 含1 mmol/L EDTANa2·2H2O，pH 8.1（16 ℃）缓冲液充分悬浮沉淀后，将所得溶液吸入准备好的透析袋MD34内流动水透析过夜，用聚乙二醇20 000浓缩蛋白溶液至适当体积，离心弃沉淀，取10 μl上清检测酶活，并测定溶液中蛋白质浓度，并且将这蛋白溶液作为离子交换层析的上样样品。
1.2 DEAE Sepharose FF离子交换层析
用50 mmol/L乙醇胺HNO3 pH 9.5（RT，16 ℃）含10 mmol/L NaNO3缓冲液平衡树脂后，将盛树脂的烧杯置于超声波清洗器内50 ℃水浴脱气3 h。用3倍于柱体积（300 ml）的缓冲液平衡树脂，上样3 ml，采用0.8 mol/L NaNO3（用相同缓冲液配制）进行梯度洗脱。从分部收集的每个试管中吸取50 μl液体于酶活测定缓冲液中，加入底物后检测溶液中是否有酶活性，将检测到有酶活的试管集中，用超滤管进行浓缩和脱盐处理。对浓缩后的样品进行酶活检测，测定溶液中蛋白质浓度。
1.3 Sephadex G75凝胶层析
将已平衡并脱气的Sephadex G75凝胶装柱后用50 mmol/L乙醇胺-HNO3含0.2 mol/L NaNO3的缓冲液平衡（总体积200 ml）凝胶后准备上样。上样量约为3 ml（ 100 ml 凝胶）。当紫外检测仪显示有蛋白流出时开始分部收集，控制流速为1滴/3 s，每管收集约1.5 ml，吸取50 μl用于检测酶活，并且分别标记有酶活的管号，用超滤管分别对每管样品溶液进行浓缩和脱盐处理，对浓缩后的样品进行酶活检测和蛋白质浓度测定。
1.4 粗酶液的NativePAGE活性染色与分析
粗酶液（经硫酸铵盐析后的浓缩样品）经非变性聚丙烯酰胺凝胶（浓度9%分离胶浓度）电泳后，将2块mini胶均放入含有胆红素的酶活测定缓冲液平皿内，缓冲液的量以将润色条完全浸入为宜，在37 ℃的恒温培养箱内放置15～20 min，当凝胶由黄色变为绿色（或紫色），并以此确定胆红素氧化酶所在位置，准确切下变色（紫色和绿色）的胶条，将其分开放入Dtube透析管中，100 V电泳12 h后，反相电泳1～2 min，将透析管中液体吸出置于超滤管中浓缩，吸取10 μl做SDSPAGE检测，另一块胶继续放置在37 ℃下保持1 h。
1.5 纯化后样品SDSPAGE检测
取过Sephodex G75凝胶分部收集的浓缩样品10 μl做SDSPAGE检测[8]，以确定蛋白质的纯度及其浓度，并且测定蛋白的分子量[9]。
1.6 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI TOF）
取适量经SDSPAGE获得单一条带的样品作为上样样品，质谱试验在AB 4800 plus MALDI TOF/TOFTM Aalyzer（USA） 上完成；所有的质谱数据采用GPS ExploredTM软件分析，搜索引擎是Mascot，数据库为NCBI。
1.7 胆红素氧化酶酶学性质
1.7.1 米氏常数（Km）的测定。
利用LinwerverBurk[10]双倒数作图法测定。底物分别为胆红素，λmax=440 nm；2，2-连氮双（3乙基苯并噻唑6磺酸，ABTS）（sigma），λmax=420 nm。胆红素的测定体系为15 mmol/L TrisHCl，36 ℃ pH 7.5；ABTS测定缓冲体系为0.1 mol/L柠檬酸磷酸氢二钠，36 ℃ pH 4.0。以加入底物后30 s之内不同底物特征吸收波长的吸光度值变化来计算反应速度（V）。
1.7.2 温度对酶活的影响。
温度梯度设为：20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃。配制浓度为0.05 mol/L TrisHCl缓冲液（含1 mmol/L EDTA），每份100 ml分装于小烧杯中，高压灭菌后，等其温度降至室温后，在不同温度下预热缓冲液15 min，用HNO3或NaOH调缓冲液pH至7.6。取3 ml预热的缓冲液于10 ml小试管中，加酶液 10 μl，并置于相同温度下放置15 min。加入底物20 μl，反应3 min后在440 nm处检测酶活性。取灭菌小试管（10 ml）加入3 ml灭菌的酶活，测定缓冲液，在每管加入酶液20 μl后，将其分别置于不同温度下，定期吸取100 μl，测定酶活，每个处理重复3次。
1.7.3 pH对酶活的影响。在25 ℃水浴条件下，分别配制50 mmol/L的柠檬酸-Na2HPO4（pH 4.0～7.5）、TrisHNO3（pH 8.0～9.0）及乙醇胺-硝酸（pH 9.5～10.0）缓冲液，pH梯度为0.5，在3 ml体系中加入酶液10 μl，在25 ℃下测定酶活。分别吸取pH为4、5、6、7、8、9、10的上述缓冲液3 ml，过滤除菌后将其置于灭菌的10 ml小试管中，加入酶液30 μl，25 ℃条件下放置，定期吸取100 μl测定其酶活，每个处理3次重复。
1.7.4 抑制剂对酶活的影响。
用蒸馏水配制0.1 mol/L迭氮钠（NaN2），在3 ml酶活测定缓冲体系（不含EDTA）中使其终浓度分别为4、6、8、10 mmol/L，测试条件同上。
用蒸馏水配制0.1 mol/L尿素（脲），在3 ml体系中使其终浓度分别为4、6、8、10、20、100、500 mol/L，测试条件同上。
1.7.5 溶解氧对酶活的影响。
用蒸馏水配制新鲜的15 mmol/L TrisHCl 缓冲液pH 7.4（36 ℃）（含1 mmol/L EDTA）500 ml，平均分装为2份，一份置于超声波清洗槽内，在水温60 ℃，功率为80%，超声处理3 h（标记为无溶解氧处理）；另一份室温放置作为对照（标记为有溶解氧处理）。分别吸取不同的缓冲液各3 ml加入酶液10 μl，底物20 μl，在440 nm处36 ℃条件下反应3 min，计算相对酶活。每个处理3次重复。
1.7.6 等电点的测定。
用等电聚焦方法测定。纯化后蛋白样品上样量15 μl；水化液（8 mol/L尿素、浓度2% CHAPS、浓度2% IPG Buffer（pH 4～7）、浓度0.002%溴酚蓝）110 μl。
2.2 NativePAGE电泳分析
盐析后的粗酶液经活性聚丙烯酰胺电泳后，将凝胶放入酶活测定缓冲液中，于37 ℃下加入适量胆红素溶液染色15 min。由图1可知，凝胶的染色后的颜色变化过程是先由黄色（胆红素溶液颜色）变为绿色，继而由绿色变为紫色，再由紫色变为无色透明。从凝胶染色—颜色变色变化—脱为无色时颜色变化的时间先后顺序、位置能够判断出在电泳条件下，BOD主要集中在分离凝胶的起始至凝胶的1/2处范围内。由于高浓度的BOD与其底物胆红素作用先产生胆绿素，随即高浓度的胆绿素可继续在该酶的催化下产生紫色化合物，相反在低浓度胆红素氧化酶区域酶与底物作用的机会要比前者少得多，形成的胆绿素的量相对少，底物转化为产物的时间要比高浓度区域延迟，故而2个区域在与底物接触相同的时间内可看到紫色和绿色同时存在的现象。
2.3 SDSPAGE电泳分析
经一系列的蛋白纯化过程，得到的纯化蛋白经SDSPAGE后得到单一条带如图2箭头所示。所得蛋白溶液中蛋白的含量约为20 μg/μl，表观分子量约为68 kDa。2.5.2 温度对酶活的影响。
由图4可知，在低温条件下BOD酶活随温度的升高而升高，温度高于40 ℃时酶活性开始下降，温度高于60 ℃时酶活性丧失。酶活稳定性的测定结果表明，该酶在50 ℃下1 h丧失酶活性；在40 ℃下12 h，残余酶活约为10%；在37 ℃下，24 h后残余酶活性为80%，62 h后残余酶活性为25%；在4 ℃下，180 d后，残余酶活性为86%；在-20 ℃或-40 ℃下，368 d后残余酶活为90%。
2.5.3 pH对酶活的影响。由图5可知，胆红素氧化酶的最适pH为7.5，且该酶在pH 8.0～9.5下能够保持较高的酶活。
2.5.4 抑制剂对酶活的影响。由图6可知，当叠氮化钠浓度
达20 mmol/L时酶活丧失80%以上；尿素对BOD的影响微小而繁杂，在低浓度的尿素（4～10 mmol/L）条件下，随着尿素含量的升高酶活呈上升趋势；而随着尿素浓度的升高酶活又呈下降趋势，但尿素浓度在20～100 mmol/L范围内时，酶活性几乎保持不变；当尿素浓度高于100 mmol/L时，酶活又呈缓慢上升趋势直到恢复原始酶活并且不再随尿素浓度的上升而发生变化。
3 结论
通过对Bipolaris australiensis HD1菌株的发酵液上清依次进行硫酸铵沉淀、DEAE Sepharose FF离子交换交换层析和Sephadex G75凝胶过滤层析，对分部收集的具有BOD酶活的组分分别浓缩，样品经SDSPAGE，获得该BOD的电泳级纯化蛋白，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法和蛋白同源序列比对，该蛋白与来源于Helminthosporium triticivulgaris（燕麦长蠕孢霉）的漆酶前体蛋白序列同源性达100%；该BOD的分子量约为68 kDa；pI约为4.1；酶的动力学结果显示该酶对常规漆酶底物和胆红素的亲和力相当 ，其米氏常数分别为Km（ABTS）=1.8×10-5 mol/L（pH 3.0）和Km（bilirubin）=2.7×10-5mol/L（pH 7.5），是一个具有较高漆酶和胆红素氧化酶酶活性的新型蛋白；该酶对胆红素的最适催化活性为36 ℃，酶在低温（<-40 ℃）下可长期保持其酶活性；在pH为8.0～9.5时可保持相当高的催化胆红素活性；该BOD能够耐受高浓度的硝酸钠和尿素；低浓度的叠氮化钠对酶活有促进作用而高浓度则抑制；该酶对氯化钠、溶解氧敏感。
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