[摘要]以胆红素代谢过程中UGT1A1酶介导的胆红素葡萄糖醛酸结合环节为切入点，通过考察待测物大黄素对该酶的抑制作用预测其肝毒性。以胆红素为UGT1A1酶底物，于人肝微粒体、大鼠肝微粒体及人重组UGT1A1酶中加入不同浓度胆红素及大黄素，分别以胆红素的总代谢产物生成量对胆红素底物浓度作图，以米氏方程双倒数法绘图，并以不同曲线的斜率对应胆红素底物浓度绘制slop图计算表观抑制常数Ki，考察其对胆红素葡萄糖醛酸结合的抑制作用，预测其肝毒性有无及大小。结果显示大黄素在3个体系中对UGT1A1酶均有中强抑制作用，且抑制类型均为竞争型抑制。HLM，RLM，rUGT1A1体系的Ki分别为（5400±0956），（10020±0611），（4850±0528），P均<005。同时发现，大黄素对于UGT1A1酶的抑制在大鼠及人之间无明显种属差异。大黄素可通过抑制UGT1A1酶活性导致胆红素代谢异常，从而存在引发肝毒性的潜在危险。该试验所建立的体外研究方法为中药肝毒性药物的筛选提供了新思路和新方法，对中药安全性评价具有借鉴意义。
[关键词]大黄素； 肝毒性； 代谢酶； 肝微粒体； 表观抑制常数
Hepatotoxicity of emodin based on UGT1A1 enzymemediated
bilirubin in liver microsomes
WANG Qi1， DAI Zhong1， ZHANG Yujie2*， MA Shuangcheng1*
（1 National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 100050， China；
2 Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）
[Abstract]To study the hepatotoxicity of emodin based on bilirubin metabolism mediated by glucuronidation of UGT1A1 enzyme In this study， three different incubation systems were established by using RLM， HLM， and rUGT1A1， with bilirubin as the substrate Different concentrations of bilirubin and emodin were added in the incubation systems The double reciprocal Michaelis equation was drawn based on the total amount of bilirubin glucuronidation The apparent inhibition constant Ki was then calculated with the slope curve to predict the hepatotoxicity The results indicated that emodin had a significant inhibition to the UGT1A1 enzyme in all of the three systems， with Ki=5400±0956（P<005） in HLM system， Ki =10020±0611（P<005） in RLM system， Ki=4850±0528（P<005） in rUGT1A1 system Meanwhile， emodin had no significant difference between rat and human in terms of inhibition of UGT1A1 enzyme Emodin had a potential risk of the hepatotoxicity by inhibiting the UGT1A1 enzyme activity And the method established in this study provides a new thought and new method to evaluate hepatotoxicity and safety of traditional Chinese medicines
[Key words]emodin； hepatotoxicity； metabolic enzyme； human liver microsome； apparent inhibition constant
doi：10.4268/cjcmm20162321
尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶（uridine 5′diphosphate glucuronosyltransferases， UGTs）是人体中最重要的二相代谢酶，能催化具有羟基、巯基、胺基、羧基和稀醇基团的脂溶性药物或内源性物质与尿苷5′二磷酸葡萄糖酸酸的结合，使其水溶性增加，从而随尿与胆汁排出，防止内源和外源性物质在体内蓄积产生毒性[1]。UGT1A1是人体UGTs家族中非常重要的一员，能代谢内源性物质胆红素和炔雌醇等[26]。胆红素是人体内一种非常重要的内源性物质，是临床上判定黄疸的重要依据，也是肝功能的重要指标和肝损害的重要生物标志物。胆红素在体内主要由UGT1A1酶转化为水溶性胆红素葡萄糖醛酸结合物BMG1，BMG2，BDG，从肝细胞分泌至胆汁中消除[78]。若UGT1A1酶受到外源性药物抑制，UCB无法转化为BG或转化减少，胆红素代谢则出现障碍，继而导致UCB在肝细胞和血液内蓄积，引发毒性。因此考察药物对UGT1A1介导的胆红素葡萄糖醛酸结合的影响将有助于预测该药物对肝脏是否具有毒性及毒性大小。
近年来文献报道[913]中药及其制剂导致的肝损伤病例逐年增加，如何首乌及其制剂，患者往往出现胆红素水平显著升高等症状[14]。大黄素在何首乌中含量较高，且其广泛存在于常用中药材（如大黄，芦荟，首乌藤，虎杖）中，因此本试验选取大黄素为待测药物，在前期试验的基础上[1516]，以表观抑制常数Ki为评价指标，考察不同肝微粒体体系（人重组UGT1A1酶，人肝微粒体，大鼠肝微粒体）中大黄素对UGT1A1酶活性的影响，旨在排除由于单一酶系所处环境不同，及不同种属间UGT1A1酶的差异，从而更加真实准确的预测大黄素肝毒性大小。
1材料
Waters AcquityTM Ultra Performance LC超高效液相色谱仪（美国，Waters公司）；Waters XevoTMQTOFMS质谱系统（美国，Waters公司）；METTLER TOLEDO AE240型电子天平（瑞士，梅特勒托利多公司）；节能型职能恒温槽SDC6（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Thermo 17R型高速低温离心机（日本，Thermo公司）。
人肝微粒体（HLM，50人混合），大鼠肝微粒体（RLM，雌雄混合），重组人UGT1A1酶（rUGT1A1）均购自美国BD Gentest公司；磷酸钾（纯度≥98%）、氯化镁（纯度≥98%）、抗坏血酸（纯度≥98%）、三羟甲基氨基甲烷（Tris，纯度≥98%）均购自百灵威科技；葡萄糖二酸单内酯（纯度≥98%）、丙甲菌素（纯度≥98%）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA，纯度≥98%）、二甲基亚砜（DMSO，纯度≥98%）均购自Sigma Aldrich公司；胆红素（批号100077201206，纯度993%），大黄素（批号110756201512，纯度987%）均购自中国食品药品检定研究院；甲酸、盐酸均为分析纯（北京化学试剂厂），乙腈、甲醇均为色谱纯（Fisher公司）。
2方法与结果
21UPLC条件
Acquity UPLC HSS C18色谱柱（21 mm×100 mm， 18 μm）；Acquity UPLC HSS C18VanGuard Precolumn预柱（21 mm×5 mm， 18 μm）；流动相乙腈（A）01%甲酸溶液（B），梯度洗脱，0～21 min，40%～75%A，21～42 min，75%～95%A，42～80 min，95%A，80～85 min，95%～40%A，85～125 min，40%A，流速04 mL·min-1；柱溫35 ℃；检测波长450 nm；进样量10 μL。
22UDPGA发生系统的制备
精密称取氯化镁、葡糖二酸单内酯、丙甲菌素、UDPGA适量，用TrisHCl缓冲液（称取Tris 1211 g，加入去离子水800 mL，加浓盐酸调pH至74，以去离子水定容至1 000 mL）使溶解，使含氯化镁5 mmol·L-1，葡糖二酸单内酯5 mmol·L-1，丙甲菌素25 mg·L-1，UDPGA5 mmol·L-1，即得UDPGA发生系统。
23溶液的制备
231对照品溶液的制备分别精密称取胆红素、大黄素对照品适量，加DMSO溶解制成不同浓度系列溶液：胆红素036～335 μmol·L-1，大黄素036～1165 μmol·L-1（HLM体系），036～1165 μmol·L-1（RLM体系），039～316 μmol·L-1（rUGT1A1体系）。
232样品溶液的制备取冻存HLM（RLM，rUGT1A1）融化，使酶蛋白质量浓度均为05 g·L-1，加入底物胆红素溶液及大黄素溶液，置37 ℃恒温水浴预孵育3 min后加入新鲜配制的UDPGA发生系统溶液启动反应。反应10 min（RLM体系为15 min）后立即加入600 μL冰乙腈甲醇（2∶1，含抗坏血酸浓度为200 μmol·L-1） 终止反应，沉淀蛋白，涡旋1 min，13 000 r·min-1（r=5 cm）离心25 min，取上清液即得。体系终体积为200 μL，DMSO总用量不超过1%。结果见图1。
24方法学考察
241日内、日间精密度考察按232项制备样品溶液，仅加入底物胆红素，使含胆红素浓度为05，5，50 μmol·L-1，按上述液相色谱条件测定胆红素高、中、低3个浓度下底物胆红素及代谢产物，每个浓度平行5份，日内及日间（连续5 d）进样测定。RSD均小于50%，结果符合规定。
242回收率考察按232项制备样品溶液，仅加入底物胆红素，使含胆红素浓度为05，5，50 μmol·L-1，按上述液相色谱条件测定胆红素高、中、低3个浓度下回收率，每个浓度平行5份，回收率870%～115%，结果符合规定。
243标准曲线按232项制备样品溶液，仅加入底物胆红素，按上述液相条件测定胆红素HLM体系中标准曲线。胆红素线性范围分别为：HLM体系中315×10-7～106×10-6 mol，Y=259×105X-3 3471（R2=0994），RLM体系中在565×10-7～892×10-6mol，Y=259×105X-2 3161（R2=0984），rUGT1A1体系中在389×10-7～164×10-6 mol，Y=259×105X-4 0121（R2=0996）。
25大黄素对UGT1A1酶活性的影响
按23所述方法，分别以胆红素的总代谢产物生成量对胆红素底物浓度作图，以米氏方程双倒数法作图测定，横坐标为底物胆红素浓度的倒数（1/c），纵坐标为加入大黄素后胆红素代谢反应速率的倒数（1/v）；加入不同浓度大黄素对应不同曲线，以不同曲线的斜率对胆红素底物浓度绘制slop图，求得抑制常数Ki；大黄素在HLM，RLM，rUGT1A1中对UGT1A1酶动力学参数的影响，及对UGT1A1酶的抑制情况见图2。
数据结果采用SPSS Statistics 170统计软件进行单因素方差分析（OneWay ANOVA），结果发现，大黄素在3个体系中，对UGT1A1酶均有中强抑制作用，且抑制类型均为竞争型抑制。HLM，RLM，rUGT1A1體系的Ki分别为（5400±0956），（10020±0611）（4850±0528），P均<005。同时不同体系间进行多重比较发现Ki无明显差异。分析试验结果发现，3个体系中，大黄素对于UGT1A1酶的Ki无统计学差异，表明大黄素对于UGT1A1酶的抑制在大鼠及人之间无明显种属差异。大黄素可通过抑制UGT1A1酶活性导致胆红素代谢异常，从而存在引发肝毒性的潜在危险。
3讨论
大黄素为蒽醌类成分，广泛存在于廖科植物中，如大黄，何首乌，虎杖等，具有重要的药理活性，广泛的生物活性，在中成药中的应用较为普遍[17]。有文献报道[18]，大黄素在体内的主要代谢途径为UGT代谢，无论在哪种（小鼠、大鼠、豚鼠、狗、人）肝微粒体酶作用下，大黄素都会迅速代谢并生成葡萄糖醛酸结合物，Ⅱ相代谢反应明显快于I相代谢反应
并占主导地位。因此本课题以Ⅱ相代谢体系为研究对象，以胆红素代谢过程中UGT1A1介导的胆红素葡萄糖醛酸结合环节为切入点，从代谢酶角度考察大黄素肝毒性，试验结果发现，大黄素对于不同种属下UGT1A1酶有较强抑制作用，且在人及大鼠间无明显种属差异，提示大黄素具有潜在致肝毒性风险。本试验为中药肝毒性药物的筛选提供了新思路和新方法，对中药安全性评价具有借鉴意义。
[参考文献]
[1]Scriver C R The metabolic & molecular bases of inherited disease[M] NewYork： McGrawHill，2001
[2]Bosma P J， Seppen J， Goldhoorn B， et al Bilirubin UDPglucuronosyltransferase 1 is the only relevant bilirubin glucuronidating isoform in man[J] J Biol Chem，1994，269（27）：17960
[3]Lepine J， Bernard O， Plante M， et al Specificity and regioselectivity of the conjugation of estradiol， estrone， and their catecholestrogen and methoxyestrogen metabolites by human uridine diphosphoglucuronosyltransferases expressed in endometrium[J]. J Clin Endocrinol Metab，2004，89（10）：5222
[4]Itaaho K， Mackenzie P I， Ikushiro S， et al The configuration of the 17hydroxy group variably influences the glucuronidation of betaestradiol and epiestradiol by human UDPglucuronosyltransferases[J] Drug Metab Dispos， 2008，36（11）：2307
[5]Watanabe Y， Nakajima M， Ohashi N， et al Glucuronidation of etoposide in human liver microsomes is specifically catalyzed by UDPglucuronosyltransferases 1A1[J] Drug Metab Dispos，2003，31（5）：589
[6]Wen Z， Tallman M N， Ali S Y， et al UDPglucuronosyltransferases 1A1 is the principal enzyme responsible for etoposide glucuronidation in human liver and intestinal microsomes： structural characterization of phenolic and alcoholic glucuronides of etoposide an estimation of enzyme kinetics[J] Drug Mebal Dispos， 2007，35（3）：371
[7]Vitek L，Ostrow J D Bilirubin chemistry and metabolism metabolism，harmful and protective aspects[J]Curr Pharm Des，2009，15（25）：2869
[8]Hoekstra L T，de Graaf W， Nibourg G A et alPhysiological and biochemical basis of clinical liver function tests：a review[J].Ann Srug，2013，257（1）：27
[9]刘芳，李波药物引起肝脏损伤的评价与检测[J]药物分析杂志， 2010，30（10）：1981
[10]方红玫，朱延焱. 何首乌有效成分、毒性作用和相关研究进展[J]. 国际药学研究杂志，2010，37（4）：283
[11]Hinshaw L BSepsis/septic shock： participation of the microcirculation： an abbreviated review[J] Crit Care Med，1996（6）：1072
[12]路璐，王勤英药物性肝损伤143例临床分析[J]中国医药，2016，11（6）：833
[13]Kyoung Ah Jung， Hyun Ju Min， Seung Suk Yoo， et al Druginduced liver injury： twenty five cases of acute hepatitis following ingestion of Polygonum multiflorum Thunb [J] Gut Liver，2011，5（4）：493
[14]鄢良春，赵军宁，邱雄何首乌安全性问题研究进展[J]中药药理与临床，2009，25（3）：77
[15]汪祺，张玉杰， 戴忠， 等微粒体体系中胆红素及其代谢产物测定方法的建立[J] 药物分析杂志，2015，35（9）：37
[16]汪祺， 戴忠， 张玉杰，等基于二相代谢酶介导胆红素代谢考察不同体系UGT1A1酶动力学参数[J]中国药学杂志，2015（19）：56
[17]蔡进章，林崇良，王贤亲，等6种蓼科植物药材大黄素含量比较[J]中华中医药学刊，2012，30（6）：1372
[18]刘薇大黄素肝肠代谢特征及性别差异研究[D]广州：南方医科大学，2010
[责任编辑曹阳阳]
相关热词搜索： 胆红素 微粒 毒性 代谢 考察
