苜蓿抗寒性研究进展

摘要： 在国内外大量研究成果的基础上，对苜蓿经过低温胁迫后的形态、生理生化方面的变化，苜蓿秋眠性与抗寒性的关系，现代生物技术以及辐射诱变和太空搭载在苜蓿抗寒育种中的应用进行了系统阐述，讨论了当前苜蓿抗寒性研究工作中存在的不足，并对未来的研究重点进行了展望。

关键词： 苜蓿；抗寒性；研究进展

中图分类号： S 54 文献标识码： A 文章编号： 1009-5500(2012)03-0091-06

苜蓿（Medicago sativa）起源于小亚细亚、外高加索、伊朗和土库曼高地，是一种优良的豆科牧草，素有“牧草之王”的美称。苜蓿在农牧业生产中起着重要作用，是家畜的主要优良饲草，无论是青草还是干草，都具有品质优良、适口性好的特点。也是农作物的良好前茬，可以提高后茬作物的产量。苜蓿也是水土保持植物、蜜源植物，也可以作为蔬菜、食品利用\[1\]。正因为如此，苜蓿在世界范围内具有广泛的栽培面积，约有3 300万hm2，其中，北美洲所占比重最大，欧洲次之，第3位是南美洲，相继为亚洲，非洲，大洋洲最少。美国种植面积最大，超过1 000万hm2，阿根廷为700多万 hm2。进入21世纪以来我国的栽培面积在一直维持在230～260万hm2\[2-5\]。在我国北方高纬度、高海拔地区，由于低温、干旱等原因造成苜蓿的越冬率低，且容易发生冻害和死亡现象，从而造成苜蓿的大面积减产。低温已经成为限制我国北方苜蓿产业发展的重要环境因素。苜蓿的越冬问题也已经成为制约我国北方苜蓿草地成功建植和草地可持续利用的关键问题\[6\]。因此，研究苜蓿的抗寒性具有重要的理论和实际意义。

1 苜蓿的形态结构与抗寒性关系

1.1 茎叶的形态结构与抗寒性的关系

茎和叶作为植物暴露在环境中的组织或器官最易受到并反映环境诸因子变化所带来的影响。目前，有关苜蓿茎叶形态结构对低温适应性的报道较少。刘香萍等\[7\]研究发现，叶节长度与抗寒性之间相关性不大，但第一真叶叶腋枝条长度却与抗寒性呈显著正相关，可作为评价苜蓿抗寒性能的参考指标\[7\]。孙启忠等\[8\]研究表明，播种当年分枝数的多少、株高及单株重量在不同播期间差异显著，播种期越早则分枝增多、株高及单株重提高，苜蓿越冬率也相应增加。崔国文等\[9\]研究结果报道，苜蓿的越冬率与叶片宽长比呈显著负相关，叶片相对窄的品种，其越冬能力强，抗寒性较好，反之则差。同时气孔密度大，叶片组织紧密度大、疏松度小，叶脉凸起度大的苜蓿抗寒性较强。

1.2 根系类型与抗寒性

根系是植物吸收和贮存营养物质的重要器官，根系生长发育的状况直接影响到地上部分的产量。苜蓿为轴根型植物，根系发达\[10\]。苜蓿的抗寒性在很大程度上取决于根系，其根系具有3种类型：直根型、根茎型、根蘖型。根茎型苜蓿可形成地下茎，可以自身更新，当主根枯死后，可与母株分离而保持独立生存，因此比单个主根更能忍受冻害\[11-13\]。根蘖型苜蓿因具有大量侧根（水平根）而具有较强的抗寒性。但国内一些地区引种观察表明，根蘖型苜蓿并不表现出比直根型苜蓿更抗寒，根蘖型特性具有非常明显的地域性，由此造成了抗寒性的差异\[14\]。因此，关于根系类型与抗寒性的关系还有待于进一步研究。

苜蓿的根颈与抗寒性关系密切。根颈是苜蓿根与茎的结合部位，也是地上部分和地下部位物质交换过程中，营养物质贮藏的枢纽部位，在苜蓿的生长过程中，根颈能形成大量的芽，从而形成地上部茎枝，也是越冬芽着生的部位。并且可以随着生长年限的增加逐渐加粗和向土中深入。当温度变化幅度大时，苜蓿根颈容易受到伤害。在冷热交替变化中，根颈细胞间隙水分发生冻融交替变化，会引起根颈和根细胞受损。对受冻害后紫花苜蓿根颈再生方法的研究发现，通过除去冻害部位，可防止根系继续腐烂，使根系与地面的距离变短或露出地面从而增加光照强度，可促使未受冻害的根系发芽\[15\]。根颈入土越深根颈越粗，越容易越冬。孙启忠等\[16\]在苜蓿播种时不同覆土厚度的研究中发现覆土厚根颈入土深，根颈受冻害的可能减小，同时根颈的入土深度又促进了根颈生长膨大，增强了植株的耐寒性，从而提高了越冬率。史纪安等\[17\]通过对不同秋眠级别的紫花苜蓿品种根系发育能力的研究，结果表明根颈分枝能力强、增粗速度快,入冬前根颈粗壮入土较深,积累越冬营养物质多,有利于翌年萌发枝条和实现高产,同时根颈随气温下降而向土壤中下移,提高冬季的抗寒能力。

2 低温下苜蓿植株的生理生化的适应

性变化

植物只有在生长过程中不断的与环境进行物质和能量的交换才能维持其生命活动。外界环境条件的好坏直接决定着植株的生存状况。尤其是不良环境，会引起植物体内一系列的生理生化变化，主要表现为对生长和发育的抑制，严重时会导致植株的死亡。

2.1 细胞膜透性与抗寒性

苜蓿的抗寒性与细胞膜透性有着密切的关系。在低温胁迫下，苜蓿的细胞膜受损，膜透性增大。而抗寒性强的品种其细胞膜透性较抗寒性差的品种要小，电解质渗出率低\[18,19\]。邓雪珂等\[20\]通过对苜蓿进行0～-7 ℃冷处理后测定了离体叶片的质膜电导率，结果表明，随着温度的降低，苜蓿叶片的电导率总体呈现增长趋势。在0～-3 ℃时，与未经低温胁迫相比呈缓慢增加，而在-3～-4 ℃之间时电导率明显增加，表明叶片细胞的质膜通透性增大。由此可以看出，当超过-4 ℃时，苜蓿的叶片质膜就会受到严重的冰冻伤害，而对于-3 ℃的低温就有较好的抵御能力\[20\]。

2.2 碳水化合物与抗寒性

当植物经受低温胁迫时，植物组织的胞内糖含量会呈现增加的趋势。研究认为糖可以经低温代谢产生未知有效变化，或者通过渗透作用增加植株的抗性。有报道称低温下植株中可溶性糖的积累是作为渗透调节物质和防脱水剂而起作用，在低温胁迫下，可以降低细胞水势、增强持水力\[21\]。有报道苜蓿主根中非结构性碳水化合物（蔗糖、葡萄糖、总还原糖及总糖）的浓度抗寒性形成阶段明显增加但在春天苜蓿返青时下降\[22\]。陶雅等\[23\]通过对国内外6个紫花苜蓿品种在不同时间的根部可溶性糖含量的动态变化分析，结果表明，苜蓿根内的可溶性糖含量从9月中旬开始升高，11月中旬达到最高峰，之后开始逐渐下降，一直延续到次年5月中旬，说明可溶性糖是一种低温保护物质，能够提高苜蓿对低温胁迫的适应。但也有研究认为，在冷适应阶段糖积累并没有随品种抗寒性的不同而表现出明显的趋势性变化。越冬率低的Aurora苜蓿含糖量一直处于较高水平,这可能是这一品种存活植株对当地气候条件适应性的反应\[24\]。因此，不能单纯把糖分含量作为区别苜蓿抗寒性强弱的指标。有关可溶性糖与抗寒性的关系还有待于进一步研究。

2.3 脯氨酸与抗寒性

氮代谢是植株体内最基本的物质代谢之一，是植物正常生长发育的物质基础。研究结果表明，氮直接关系到苜蓿的再生与返青，苜蓿再生及返青时所消耗的氮均来自根部。随着气温逐渐变低，苜蓿根部氨基酸总量会显著升高，并在冬季维持较高的水平，直到第2年早春返青时下降。游离脯氨酸作为细胞质的渗透调节物质在植物对抗低温胁迫时起到平衡细胞代谢的作用，以保持细胞内环境的相对稳定\[25\]。有试验结果表明，当受到低温胁迫时，植株游离脯氨酸的含量开始上升，随着低温处理时间的延长，紫花苜蓿游离脯氨酸的含量有大幅度的增加，特别是在低温胁迫12 h后，增长十分明显，说明游离脯氨酸在紫花苜蓿中作为一种植株耐寒性相关物质而存在，随低温胁迫的时间增加逐渐积累，在12 h后相关积累机制大量激活，导致其含量急剧上升\[20\]。这证明了苜蓿对低温的适应机制是通过提高胞内小分子物质的绝对含量来实现的；脯氨酸绝对含量的增加有利于提高苜蓿的抗寒性\[26\]。

2.4 脂肪酸与抗寒性

植物的细胞膜脂肪酸的不饱和程度越高，其相变温度越低，抗寒性越强。在低温锻炼时苜蓿抗寒品种的脂类增多，其中，主要是亚油酸和亚麻酸含量增加以及膜组分磷脂的增加。苜蓿细胞膜脂肪酸的不饱和程度升高，类脂的相变温度下降，这时细胞膜从正常的生理活动状态液晶态转变为结晶态，可在低温下维持细胞膜的正常功能，因而苜蓿的抗寒能力增强\[27\]。夏明等\[28\]通过对20种苜蓿叶片膜脂脂肪酸组分和变化的分析，发现在5 ℃低温状态下，苜蓿品种间叶片膜脂棕榈稀酸和亚麻酸含量高、变化率大，表现出对低温环境的敏感，为苜蓿的抗寒指示性脂肪酸。

2.5 保护酶系统变化与抗寒性

在正常情况下，植物体内活性氧和自由基的产生和清除之间处于平衡状态，而当植物受到低温胁迫时，这种平衡就会受到破坏，植物细胞就会受到损伤。植物体内活性氧清除剂包括抗氧化酶和抗氧化剂。其中，抗氧化酶主要有：超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）、谷胱甘肽还原酶（ＧＲ）等。非酶性的抗氧化剂如坏血酸（ＡＳＡ）、谷胱甘肽（GSH）和维生素E等\[29\]。SOD、POD是植物对膜脂过氧化的酶促防御系统中重要的保护酶，SOD在细胞保护酶系统中的作用是清除超氧自由基O2-，同时产生歧化产物H2O2。POD在保护酶系统中主要起到酶促降解H2O2的作用，从而使植物抵抗在逆境胁迫下代谢过程产生的有害物质对细胞的伤害，表现出一定的抗逆性\[30\]。在低温胁迫初期，幼苗叶片SOD、POD活性上升，随着胁迫时间的延长，在胁迫后期苜蓿幼苗叶片SOD、POD保护酶的活性下降后仍能维持较高水平的活性，这可能是SOD、POD保护酶的活性的耐寒机制已经形成，酶的活性维持在较高水平，能够使活性氧代谢处于一定的平衡，避免了活性氧等各种自由基的大量积累，减轻了膜脂过氧化作用，降低了细胞膜的破坏程度，增强了对低温的适应能力\[23\]。杨秀娟\[31\]在对抗寒性差异较大的2个苜蓿品种于不同时期进行取样，然后测定根颈的POD，SOD和CAT酶活性，结果表明：从夏季到冬初，紫花苜蓿2个品种根颈中的POD，SOD和CAT酶活性均随着季节温度的降低而呈现先上升后下降的趋势，在初冬是达到顶峰，进入冬季深秋眠间，3种酶活性均有一定的波动，且活性明显下降。梁慧敏等\[32\]通过对秋末初冬和初春返青期同工酶的变化研究，结果表明，秋冬随温度的降低，苜蓿过氧化物酶同工酶谱带和活性明显增加，且根蘖型增加快于直根型苜蓿；而早春随温度的上升，苜蓿根系酶活性和酶带数也呈波动式变化，与温度呈明显的负相关关系，其中，对温度变化敏感的根蘖型苜蓿与直根型苜蓿相比，根酶活性始终保持较高水平，有利于及时清除细胞内的有毒物质，保护生物膜不受损害。魏臻武等\[33\]利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果表明，不同苜蓿品种具有6条共同的SOD同工酶酶带，适应高寒地区气候条件的当地材料同德杂种苜蓿表现出与其它苜蓿品种较大的特异性。

2.6 激素变化与抗寒性

随着秋冬温度的下降，植物的生长活力呈现下降趋势，植株体内的激素发生明显变化，主要表现为ABA大量增多，GA和IAA等促生长激素的减少。ABA既可以诱发与抗逆相关的新的蛋白质合成，增强抗逆性，也可以促进气孔关闭，减少水分损失，维持体内水分平衡，减少逆境伤害。有许多试验结果已经证实植物经低温处理后内源ABA含量明显增加，且抗寒性强的品种ABA含量高于抗寒性弱的品种\[34\]。对植物施加外源ABA激素会影响内源ABA激素的合成。王成章等\[35\]通过对不同秋眠类型苜蓿品种施加外源ABA的试验结果表明，无论是秋眠型、半秋眠型或非秋眠型苜蓿，喷施外源ABA对苜蓿体内ABA的积累均有极显著的促进作用；又由其株高增长变化看,高浓度外源ABA处理对苜蓿生长抑制更加明显,但秋眠型苜蓿较半秋眠型和非秋眠型更易受外源ABA诱导而增加内源ABA的累积量。因此,若施用外源ABA改变苜蓿体内的平衡状况来诱导基因的表达从而诱导秋眠反应,提高苜蓿抗寒能力,可根据秋眠级别的不同施以不同浓度的外源ABA或类似物。

3 苜蓿的秋眠性与抗寒性的关系

秋眠性是与日照变化有关的一种秋季生长特性，是对短日照的一种生长反应。在高纬度地区秋季日照长度的降低，引起苜蓿植株出现俯卧生长，且生长速度下降，这种特性即为苜蓿的秋眠性。具有这种特性的苜蓿品种即为秋眠苜蓿，而不表现这种现象的苜蓿则为非秋眠苜蓿。在极端秋眠和极端非秋眠的品种之间，还存在不同的过渡类型，并可以此将苜蓿品种分为不同的秋眠级\[36\]。国际上通常用秋眠级表示苜蓿抗寒能力的大小\[37\]。在国外，秋眠级别是苜蓿品种选择首先需要考虑的因素。美国已把苜蓿秋眠性列为品种鉴定的一个首要指标。我国对苜蓿的秋眠性研究最早的是卢欣石\[38\]，他以美国9个秋眠标准对照品种为对照，对中国23个国家审定苜蓿品种进行了秋眠性评定，分析表明中国苜蓿国家审定品种中大部分为秋眠性品种。于林清等\[39\]在2000年同样以美国9个秋眠性标准对照品种为参照，测定了我国新疆野生苜蓿种群117份材料的秋眠性，结果表明，新疆北疆苜蓿野生种群没有半秋眠种质，参试的85份苜蓿品种中，秋眠级为1的84份，秋眠级为3的1份；而我国南疆的32份中1和3级品种分别为24和2份，4和5级的分别为4和2份。许多试验表明，苜蓿品种的秋眠习性与其再生能力、潜在产量特别是苜蓿耐寒性高度相关。秋眠型苜蓿品种抗寒性强，但产量相对较低，再生较慢；非秋眠型苜蓿品种抗热抗病性强，产量高，再生快，但耐寒性差；半秋眠型苜蓿品种介于两者之间\[40\]。但是，也有学者认为秋眠性与抗寒性之间不存在因果关系，这2个性状之间之所以密切关联很可能与不同类型苜蓿的起源有关。秋眠性与抗寒性可以分离，有可能培育出既有旺盛的秋季生长（非秋眠性）、又有较强抗寒性（持久性）的苜蓿品种\[32，41\]。抗寒性与秋眠性的关系仍是今后研究中所要解决的问题之一。

4 生物技术在苜蓿抗寒育种中的应用

苜蓿抗寒育种以前主要依靠传统的育种方法，但由于周期长、效果差且工作繁琐，不能适应现代农业发展的需求\[42\]。最近10年来，随着对抗寒分子机理认识的不断加深以及生物技术的发展，人们不断尝试采用一些现代生物技术来培育抗寒新品种。杨志宏等\[43\]以准格尔苜蓿茎段诱导愈伤组织，对愈伤组织进行0～-10 ℃的低温筛选，获得抗寒性突变体，并用生理生化方法对突变的愈伤组织体细胞的抗寒性进行了鉴定，为抗寒育种提供了原始材料。李波等\[44\]对诱导的苜蓿愈伤组织进行不同浓度的硫酸二乙酯（DES）诱变处理，确定其半致死浓度，在-7℃低温下进行筛选，已获得抗寒性突变体；进行了相对电导率、游离脯氨酸含量、过氧化物酶的活性等抗寒生理指标的测定。结果表明，苜蓿愈伤组织经DES处理，DES的半致死浓度为0.3%，愈伤组织的抗寒性增强。李继平\[45\]通过转基因技术，将从拟南芥中克隆得到的冷诱导基因的转录因子CBF1转入优质高产的苜蓿植株中，得到转化植株，经过PCR分子检测初步得到转基因植株，为筛选出抗寒高产的转基因苜蓿株系奠定了基础。

5 辐射诱变与太空搭载对抗寒性影响

尚晨等\[46\]利用高能粒子场进行不同辐照剂量处理种子，研究龙牧803苜蓿M2代低温下的生理变化，结果表明高能粒子处理紫花苜蓿种子提高了苜蓿的抗寒性，在低温条件下，辐射剂量越高，辐射效应越明显。张文娟\[47\]以4个高产紫花苜蓿品种优质种子为对象，通过返回式育种卫星“神州3号”搭载，返地后进行低温胁迫处理，测定各种指标，结果表明，空间搭载对4个紫花苜蓿品种的质膜过氧化及细胞膜相对透性、游离脯氨酸含量有影响。低温胁迫下，各品种搭载组与其对照组质膜透性、丙二醛含量都呈上升趋势，搭载组质膜透性、丙二醛含量小于其对照，搭载组质膜过氧化程度小于对照；各品种搭载组与其对照组游离脯氨酸含量变化趋势一致，但随温度下降，搭载组游离脯氨酸积累量大于其对照，这些生理变化都有利于苜蓿抗寒性的提升。

6 苜蓿抗寒性研究展望

由以上可知我们对苜蓿的抗寒性已经进行了多方面的研究，并且也取得了一定的研究成果，对苜蓿适应低温的机理也有了一定的认识。但我国在苜蓿抗寒性的研究中还存在很多问题。比如：有哪些基因参与苜蓿的抗寒性形成，这些基因控制酶的形成进而影响表型变化的机制还有待于进一步研究；根系类型与抗寒性、在人工低温胁迫下保护酶变化情况与抗寒性、苜蓿的秋眠性与抗寒性的关系还不是特别清楚；快速、简洁、准确的鉴定苜蓿抗寒性的统一指标还未形成。如何在苜蓿抗寒性的研究中加大新的生物技术的应用，使传统育种技术与现代育种技术相结合，加速育种进程，快速有效的提升苜蓿的抗寒性是我们今后需要努力的研究方向。

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