材料作为基因载体的细胞毒性大小及其转染效率。方法 以聚乙烯亚胺（PEI）为对照， 化学合成髓鞘碱性蛋白68-86（MBP68-86）-多聚赖氨酸（PLL）-聚乙烯亚胺-聚乙二醇（PEG）接枝支化特异性配体乳铁蛋白 （Lf）及PLL-PEI-PEG， 并采用MTT法检测细胞毒性， 倒置显微镜荧光观察法和流式细胞仪法检测转染效果。结果 MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf细胞毒性比PLL-PEI-PEG及PEI低， 三组两两比较差异有统计学意义（P<0.05）；MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP 的转染效率为（41.8±0.9）%；PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP的转染效率为（28.4±1.1）%；PEI/pAAV-EGFP 为的转染效率（20.5±1.2）%， 两两比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论 MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf和PLL-PEI-PEG可作为基因转染的传输载体， 其中MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf最好。
【关键词】 纳米材料； MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf；基因载体；PLL-PEI-PEG
DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.20.193
目前所有的基因治疗研究领域， 都存在转基因载体系统在转染效率、定向性、可控性、安全性等方面的不足[1]。而纳米载体凭借其低毒、高效负载等优点在基因治疗中发挥越来越重要的作用。作者前期实验已经成功合成并验证了PLL-PEI-PEG[2] 。因此， 本文在前期实验的基础上合MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf， 并在体外比较不同新型靶向纳米材料的细胞毒性和转染效率， 以筛选出更加高效、低毒和高靶向性的基因载体， 为神经系统的基因治疗带来新的希望。
1 材料与方法
1. 1 细胞来源及培养 大鼠单个核细胞（PBMC）购自美国ATCC公司， 由本实验室保存。采用加有10% 胎牛血清（FBS）和1%抗生素（青霉素/链霉素）的DMEM培养基培养。
1. 2 PLL-PEI-PEG-Lf/MBP68-86的制备 MBP68-86用Traut试剂硫酸化后再与纳米材料以分子比4∶1混合， 在室温下反应1h， 去除过剩的MBP68-86。
1. 3 质粒DNA（pDNA）的制备 质粒在大肠杆菌中扩增， 然后用质粒提取试剂盒提取纯化。得到的质粒通过紫外分光光度计检测其纯度和浓度。检测合格的质粒保存于-20℃保存备用。
1. 4 MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/质粒DNA复合物的制备 在Eppendorf管中， 将1 μg pDNA稀释在50 μl不含FBS的DMEM中， 振荡均匀， 按不同N/P比把相应量的纳米材料加入到另外一管装有50 μl不含FBS的DMEM的Eppendorf管中， 然后把两溶液在室温下振荡5min得到均匀复合物。
1. 5 细胞毒性 采用四唑盐（MTT）比色法检测细胞毒性， 具体方法参见文献[2]。
1. 6 细胞转染效率 采用倒置荧光显微镜观测转染结果， 并采用流式细胞术检测转染效率， 具体转染过程及检测方法参见文献[2]。
1. 7 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2. 1 细胞毒性检测结果 采用MTT检测细胞毒性。当N/P<10时， 三种纳米材料载体的细胞存活率都>80%；在N/P=15时， MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP为78%， PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP为63%， 比PEI/pAAV-EGFP的细胞存活率（52%）要高， 两两比较差异有统计学意义（P<0.05）；N/P<15时， MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP和PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP的存活率相当， 但两者比PEI25kD/pAAV-
EGFP要高， 只是在N/P>15时MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP的细胞存活率才比PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP和PEI/pAAV-EGFP低， 两两比较差异有统计学意义（P<0.05）。
纳米材料形成复合物后在PBMC细胞中的细胞毒性。见图1。
2. 2 细胞转染效果
2. 2. 1 倒置荧光显微镜观测细胞转染效果 采用倒置荧光显微镜观测细胞转染效果， 发现在N/P=15时载体绿色荧光蛋白表达量最多， 同时MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP 的细胞荧光表达效果比PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP和PEI/pAAV-EGFP要好。
2. 2. 2 流式细胞仪检测细胞转染效果 本实验还利用流式细胞仪检测了N/P=15时三种纳米材料的转染效率， 结果发现MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP 的转染效率为（41.8±0.9）%；PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP的转染效率为（28.4±1.1）%；PEI/pAAV-EGFP 为的转染效率（20.5±1.2）%， 两两比较差异有统计学意义（P<0.05）。
3 讨论
新型纳米材料作为基因载体具有良好的安全性和生物相容性[3]。近来许多实验[4， 5]通过改变阳离子聚合物的结构或对其进行化学修饰而降低毒性， 并实现高转染效率。在以前的工作中， 作者已经成功合成并验证了靶向、高效及可降解型PLL-PEI-PEG基因载体， 并作了相关的报道[2]。由于乳铁蛋白（Lf）可通过受体介导的跨细胞转运通过血脑屏障。考虑到这一点， 作者拟将Lf主要结构序列连接到PEG末端， 从而使这种纳米材料PLL-PEI-PEG-Lf可通过跨细胞转运进入脑组织。虽因PLL-PEI-PEG-Lf可透过血脑屏障进入脑组织， 但对脑的不同组织并无特异性。因此本实验在PEG的基础上加以MBP68-86修饰， 使新的载体同时具备血脑屏障穿透性和活化的免疫细胞靶向性。
同样用量的时候MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf的毒性最低。基因载体除了应具有较低的毒性， 较高的转染效率也非常关键。MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf的转染效果较PLL-PEI-PEG及PEI好， 另外流式细胞仪检测也证实了同样的结果。由此可以得出MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf作为基因传输载体较好。
综上所述， MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf和PLL-PEI-PEG都可作为基因传输的载体， 但由于MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf作为PLL-PEI-PEG的改进品， 各方面的性能都优于PLL-PEI-PEG， 因此具有更高的可塑性和价值。
参考文献
[1]梁兵， 袁芳， 杨宁， 等. 3种不同类型基因导入系统转染类神经元细胞的效率比较.重庆医学， 2012， 41（18）：1792-1798.
[2]董亚贤， 石红婷， 梁兵， 等. 新型靶向纳米材料作为基因载体的评估. 现代预防医学， 2015， 42（13）：2405-2408.
[3]梁兵， 袁芳， 殷建瑞， 等. 纳米材料PEG-PEI介导双基因促体外拟神经细胞凋亡的作用. 山东医药， 2012， 52（25）：1-4.
[4]谢黎崖， 胡权， 吴永良， 等.叶酸和聚乙二醇双修饰的壳聚糖纳米粒的制备及其性能表征.中国现代应用药学， 2013， 30（3）：284-289.
[5]刘文文， 王晓梅， 赵永波， 等.重组大鼠质粒pEGFP-GDNF的构建及真核细胞转染.中风与神经疾病杂志， 2005， 22（2）：104-106.
[收稿日期：2016-03-31]
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