摘要：为了得到棘孢木霉（Trichoderma asperellum）发酵的最佳培养基，应用Plackett-Burman设计法对影响棘孢木霉菌丝体产量的关键因子进行了筛选，并进一步采用响应面分析法对影响菌丝产量的关键因素最佳水平进行了研究。结果表明，影响棘孢木霉菌丝体产量的关键因素为硝酸铵和硫酸镁的浓度。通过响应面分析法的拟合和推算，得到在硝酸铵和硫酸镁浓度分别为1.7 g/L和1.43 g/L时，模型预测发酵最佳产量为0.85 g/mL，验证值为0.905 g/mL，预测值与验证值之间吻合较好，约是原始培养基产量的2倍。
关键词：棘孢木霉（Trichoderma asperellum）；Plackett-Burman設计法；响应面分析法
中图分类号：Q939.96；Q813.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）23-4531-03
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.23.028
Abstract： In order to obtain the optimal medium composition for Trichoderma asperellum production， the Plackett-Burman design was used to evaluate the effects of seven variables，and the optimum levels of key factors affecting mycelium yield were conducted by response surface analysis methodology. The results showed that，the optimal values of the two parameters determined by response surface analysis methodology were ammonium nitrate 1.7 g/L and magnesium sulfate 1.43 g/L. The mycelium production was 0.85 g/mL，and the actual experimental result was 0.905 g/mL， they were in agreement and it is about two folds of the production before optimization.
Key words： Trichoderma asperellum； Plackett-Burman； response surface analysis methodology
棘孢木霉（Trichoderma asperellum）能够抑制多种病原菌，促进植物生长，诱导作物的免疫能力，而且能降解土壤中盐类化合物、农药残留等，因而被广泛应用于农林业中。早在20世纪80年代，欧洲国家就开始了棘孢木霉制剂的商品化生产，如今棘孢木霉作为生物防治微生物已经得到了广泛的应用。长期以来，中国登记的棘孢木霉制剂质量较差，货架期很短，在一定程度上影响了推广使用，因此，研究高产棘孢木霉的液体发酵条件尤为重要。
试验利用响应面法对棘孢木霉发酵的关键因素进行了优化。从Plackett-Burman试验可以得知，硝酸铵和硫酸镁对棘孢木霉的菌丝产量影响显著，所以利用响应面试验设计以这两个因素为自变量，以棘孢木霉菌丝量为响应值，通过Minitab 15软件对试验数据进行多项式回归分析，建立多元二次回归方程，利用方差分析模型和各因子的显著性获得棘孢木霉液体发酵工艺的最佳参数，以期为棘孢木霉制剂的开发提供参考[1-6]。
1 材料与方法
1.1 材料
1）菌株。棘孢木霉由湖北省生物农药工程研究中心生物技术研究室分离保存，能够拮抗多种植物病害，保存于-80 ℃超低温冰箱。
2）培养基。固体培养基：PDA培养基，2%琼脂；种子培养基（g/L）：PDA培养基；发酵培养基（g/L）：蔗糖5，玉米粉8，硝酸铵2，豆粕3，硫酸镁1，磷酸二氢钾1，后期采用优化后的配方。
1.2 方法
1）发酵培养条件。接种体积分数5%，发酵温度30 ℃，摇床转速200 r/min，发酵96 h。
2）Plackett-Burman试验。采用Minitab的Plackett-Burman两水平法对培养基成分进行考察，筛选影响棘孢木霉生物量的重要因素，确定最佳配方。设计水平和排列方式见表1。
3）最陡爬坡试验。根据Plackett-Burman试验得出的拟合方程安排最陡爬坡试验来确定因素取值中心点。拟合方程中各变量系数确定爬坡方向和变化步长，另外步长确定亦与试验条件相关。
4）中心组合设计和响应面分析。对Plackett-Burman试验确定的因素，以最陡爬坡试验得到的中心点，根据中心组合设计原理安排响应面试验获得重要因素的最佳配方水平。根据中心组合设计结果来拟合数据，得到描述响应值和自变量之间关系的二阶模型，即：
Y=b0+■bixj+■■bijxixj+■biix2i+e
式中，Y为产物能力测量值，b0为截距，bi为关键因素线性效果的系数，bii为关键因素的二次效应的系数，bij为关键因素间交互作用的系数。
根据拟合的数学模型以及方差分析结果，可以评价每个因子及其交互作用对过程的影响程度，利用响应面图和等高线图直观地描绘其结果，同时利用拟合的数学方程求解最优的结果。
5）培养基优化结果验证试验。用优化后的培养基组分配制发酵培养基，发酵结束后测定发酵液中的菌丝质量。
2 结果与分析
2.1 Plackett-Burman试验结果
据前期研究结果，确定以蔗糖和玉米粉为碳源，以硝酸铵和豆粕为氮源，并和其他几种无机盐共7种因素（X1：蔗糖，X2：玉米粉，X3：硝酸铵，X4：豆粕，X5：硫酸镁，X6：磷酸二氢钾，X7：磷酸氢二钾）一起进行Plackett-Burman设计试验，设计方案和试验结果见表1。
由t检验结果可知，硝酸铵和硫酸镁对棘孢木霉的菌絲生长具有显著影响，可信度在95%以上。且两者对棘孢木霉的菌丝生长影响是负效应。
由上述Plackett-Burman试验得到的回归方程如下：
Y=53.54-4.393 X1-1.834 X2-5.239 X3-1.098 X4-1.25 X5-1.989 X6-4.264 X7，方程拟合的相关性为R2=0.953 4，表明此多项式方程很好地模拟和解释了Plackett-Burman的试验结果。
2.2 最陡爬坡试验结果
找到对产物发酵影响最大的因素后，需要进一步对这些因素进行分析。最速上升法以前述Plackett-Burman设计试验得到的一次方程为基础，以相应因素的系数比为基准进行步移，直到步移至最高点，然后以最高点附近的范围作为响应面优化的相应范围。从Plackett-Burman设计试验得到方程中硝酸铵和硫酸镁的系数（X1∶5.239，X2∶1.25），可以得这两个因素步移的步长比为1∶0.24，即当硝酸铵步移1个单位（0.5 g/L）时，硫酸镁步移0.24个单位（0.12 g/L）。以Plackett-Burman设计中的中心点作为步移的起点，试验设计与试验结果见表2。从表2可以看出，棘孢木霉菌丝体的产量在步移进行至第三步时达到最高点，之后棘孢木霉菌丝体产量开始下降。步移最高点时硝酸铵和硫酸镁的浓度分别为1.0、1.26 g/L，这一点被用作下一步响应面分析的中心点。
2.3 中心组合设计试验结果
根据以上两水平Plackett-Burman试验可知，影响棘孢木霉生物量的两个重要因素分别是硝酸铵和硫酸镁。根据中心优化组合方法，试验设计及结果见表3，共13组试验。
以硝酸铵和硫酸镁为自变量，以棘孢木霉的菌丝湿重为响应值，根据分析结果得到的二次多项式回归方程为Y=-69.352 0+0.789 2 X1-9.699 X2-1.279 1 X12+8.070 9 X22 +12.342 5 X1X2，Y为响应值，X1为硝酸铵，X2为硫酸镁。利用Minitab软件响应优化器进行计算可得，最大值处X1=1.7 g/L，X2=1.43 g/L，在此条件下理论预测得到的菌丝湿重值为0.85 g/mL。
2.4 最佳培养基的验证
为了确定试验结果的可靠性，对上述优化条件进行了验证试验，共进行了3组平行试验，结果表明，棘孢木霉的菌丝体产量为0.905 g/mL，与预测值十分接近。
3 小结
对棘孢木霉生长培养基进行了优化研究，得到最佳培养基配方：蔗糖10 g/L，玉米粉10 g/L，硝酸铵1.7 g/L，豆粕5 g/L，硫酸镁1.43 g/L，磷酸二氢钾2 g/L。在此条件下，棘孢木霉的菌丝体理论最高产量为0.85 g/mL，验证试验中最高值为0.905 g/mL，与理论预测相符，约是优化前实际产量（0.44 g/mL）的2倍。
参考文献：
[1] 张保元，许梦秋，谢响明.粉红粘帚霉67-1液体发酵生产生物农药概述[J].现代农业科学，2009，16（3）20-21.
[2] 邹 勇，文成敬，唐贵群，等.几个因素对木霉菌株T-33产生厚垣孢子的影响[J].微生物学通报，2006，33（4）：43-47.
[3] 宋文婧，刘振邦，朱 虹，等.十种虫生真菌液体培养芽生孢子的形态发生[J].菌物学报，2011，30（4）：572-579.
[4] 高克祥，项存悌，骆会欣，等.木霉菌株T-（88）生物学特性的研究[J].东北林业大学学报，1995，23（2）：33-39.
[5] 陈建爱，肖 敏，王未名，等.木霉诱变菌株发酵条件研究[J].核农学报，2002，16（5）：305-309.
[6] 庄敬华，高增贵，刘 限，等.不同发酵条件对木霉产孢类型的影响[J].中国生物防治，2005，21（1）：37-40.
相关热词搜索： 培养基 发酵 响应 优化 棘孢木霉
