材料的可行性。方法:将制备的脱细胞组织工程血管支架预冷后置入-70℃、6.67×10-4kPa的冷冻干燥机内6 h作冷冻干燥处理。通过对冷冻干燥处理前后脱细胞血管支架材料的组织,超微结构观察、生物力学评估、细胞毒性测定以及动物体内的组织相容性检测,研究冷冻干燥处理对脱细胞血管支架材料生物相容性和生物力学特性的影响。结果:冷冻干燥处理对于脱细胞血管材料的生物力学及生物化学特性没有明显影响,处理后的材料依然具有良好的体内、外生物相容性。结论:冷冻干燥处理作为脱细胞组织工程血管支架材料的长期储存方法是可行的。
[关键词]组织工程血管;脱细胞组织工程血管支架;冷冻干燥
[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)02-0218-04
Conservation of the tissue-engineered acellular vascular scaffold with freezing and drying technique
LIU Bin1, ZHANG Man-jing2, XIA Wei1, LU Kai-hua1,GUO Shu-zhong1
(Department of Plastic Surgery, Xijing Hospital,the Fourth Military Medical University,Xi′an 710032, Shaanxi,China 2.Department of Platic Surgery,the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical College)
Abstract: ObjectiveTo investigate the feasibility of a freeze-drying technique preservation protocol on the acellular vascular scaffold.MethodsAcellular vascular scaffolds were treated by freezing and drying technique at -70℃(6.67×10-4kPa) for 6h,then appraised the scaffolds by histological and ultrastructural observation and evaluated its biocompatibility and biomechanics.ResultsIt was shown that the main performance indexes of the freeze-drying treated acellular scaffolds changed uemarkably in compared with the untreated ones.ConclusionFreeze-drying technique can be a good preservation protocol for tissue-engineered acellular vascular scaffold.
Key words: tissue engineering blood vessels; tissue engineered acellular vascular scaffold; freeze drying
随着科学技术的发展,组织工程学的兴起为从根本上解决血管移植物替代这一问题带来了新的曙光。组织工程血管是组织工程学领域的产物之一,是一种新的有望彻底解决小口径人工血管移植问题的方法。脱细胞血管基质因其具有取材方便、低免疫源性、机械性能良好等优良特性,在血管组织工程研究领域中得到了越来越广泛的应用[1-2], 成为该领域支架材料研究方面的一个热点。通过前期的系列试验研究,我们初步摸索出一种脱细胞血管支架快速制备、消毒及结构疏松化的方法。然而脱细胞血管材料制备后如何长期保存又是一个需要面临和解决的问题,因此我们希望找到一种简单可行的储存技术来长期保存制备的脱细胞血管支架以达到临床和科研上 “随用随取”的目的。
在本实验研究中我们使用冷冻干燥技术处理制备的脱细胞血管支架,通过对处理后的支架材料进行组织,超微结构观察、生物力学评估、细胞毒性测定以及动物体内的组织相容性检测,研究冷冻干燥处理对脱细胞血管支架材料生物相容性和生物力学特性的影响,从而进一步评估冷冻干燥技术作为该材料长期储存方法的可行性。
1材料和方法
1.1血管材料准备及脱细胞血管支架的制备:选取8～12月,体重在2～2.5kg的健康雄性大耳白兔20只,在麻醉、相对无菌条件下,取出兔股动脉,置于4℃含青霉素和链霉素各180mg/L的无菌PBS液中,热缺血时间不超过15min。无菌PBS液冲洗数次去除血液杂质,锐性去除附属结缔组织和脂肪成分以及大部分血管外膜。截取长度为5cm、无明显分支、内径约3mm的动脉40根作为实验材料。将所取得的30根血管材料反复冻融加超高压处理后,置人含有15μg/ml RNase A,150μg/ml DNase I (Sigma)溶液中,冲洗48h(37℃,5%CO2环境内搅拌),然后用PBS洗涤1天。
1.2脱细胞血管支架的冻干处理:取20根制备好的脱细胞血管支架材料,根据血管材料口径和长度套入相应的玻璃棒上,于普通冰箱冷冻室内-4℃预冷24～48 h,然后在-80℃低温冰箱中速冻24h,再置入-70℃、6.67×10-4 kPa的干燥冷冻机(LGJ-10C,上海)内6h作冷冻干燥处理。用包装袋封装后,置常温下保存待用,并注明冻干日期、血管种类、长度及口径,保存8周以上后使用。使用时,将血管材料由包装袋中取出,浸泡于生理盐水中复温约10min,血管变软后由玻璃棒上轻轻取下,以0.1%过氧乙酸溶液消毒。
1.3组织学观察
1.3.1 光学显微镜:4%多聚甲醛分别固定经冻干-复水处理及经未冻干处理的脱细胞血管支架标本,常规石蜡包埋切片,行苏木精伊红(HE)染色后在光学显微镜下观察。
1.3.2 扫描电镜:3%戊二醛分别预固定经冻干-复水处理及经未冻干处理的脱细胞血管支架标本,4℃储存送检。标本在S-3400N型扫描电镜下观察。
1.4 兔血管内皮细胞的分离培养:无菌条件下取出兔胸主动脉。去除附壁血细胞,剪除外膜多余脂肪和筋膜。分别注入0.125%、0.25%胰酶和0.1%胶原酶消化液,使管腔充盈,37℃作用15、12、17min,松开一端,收集消化液; 注入含10%胎牛血清 M199培养液再次冲洗管腔;将消化液和冲洗液并800r/min,5min离心,弃上清;加M199培养液,吹打均匀制成细胞悬液,以2×105/瓶浓度,传入25cm2培养瓶;37℃、5%CO2培养箱,每24h半定量换液;当原代培养至融合形成致密的单层细胞时即可传代,实验采用的细胞为第3～7代细胞。
1.5 接触细胞毒性测定:实验组将约3mm2 的无菌医用粘合膜粘贴于一次性细胞培养皿中央,无菌条件下取5mm×5mm大小冻干处理后脱细胞血管基质,黏附于细胞培养皿中。作为阳性对照组,将一滴氰基丙烯酸酯滴加至另一培养皿中央的脱细胞血管基质上;阴性对照组,培养皿中央医用粘合膜粘贴未经冻干处理的脱细胞血管基质。将准备的内皮细胞悬液依次接种于上述培养皿中,CO2培养箱中(37℃,5%CO2)孵育48h后倒置荧光显微镜下观察细胞与培养皿中央材料毗邻部位的形态。
1.6羟脯氨酸含量测定:利用羟脯氨酸检测试剂盒(南京建成)及多功能光度计分别测定分别测定新鲜血管及冻干处理前后脱细胞血管支架材料羟脯氨酸含量的变化。
1.7 处理前后材料的机械力学特性的测定:将新鲜血管及冻干处理前后脱细胞血管支架材料在INSTRUIN 1122生物力学测试系统(Instron Uo.USA)下行单轴拉伸试验,测定最终抗张强度和缝合强度。
1.8 血管支架材料冻干-复水处理后体内生物相容性的初步研究:大耳白兔以戊巴比妥钠(30～40mg/kg,iv)麻醉,取仰卧位固定于手术台上,腹部两侧去毛,碘伏消毒,铺巾。在腹部两侧各做2个切口,长约1cm,切开皮肤全层后以眼科剪仔细分离皮下形成一腔隙。把脱细胞血管基质及经冻干-复水处理的脱细胞血管基质分别植入皮下腔隙中,每侧植入2块材料,铺平,缝合切口,再次以碘伏消毒切口。无压力包扎,饲养。观察兔全身及材料种植局部反应,并分别于术后7天、14天、21天及28天取出标本,4%多聚甲醛分别固定血管支架标本,常规石蜡包埋切片,行苏木精伊红 (HE)染色后在光学显微镜下观察。
1.9 统计学分析:数据采用SPSS13.0软件处理,结果以均数x±s表示, 数据以均数±标准差表示,采用方差分析比较, P <0.05为有统计学意义。
2结果
2.1形态学观察
2.1.1 大体形态:脱细胞处理组管壁变软塌陷,但弹性良好(图1);经过冷冻干燥保存处理后的脱细胞血管支架形成特有的海绵状多孔性结构(图2);复水后脱细胞血管支架形态及大体结构完全复原(图3)。
2.1.2 经冻干处理脱细胞血管基质的组织学观察:经过冷冻干燥处理后的脱细胞血管支架,其管壁胶原纤维波浪状结构均保存基本完好,同未经冷冻干燥处理的脱细胞血管支架相比,结构无明显差异(图4、5)。
2.1.3 超微结构观察:经过冷冻干燥处理后的脱细胞血管支架结构较未处理前略疏松,但整体结构保持完好(图6、7)。
2.2 接触性材料细胞毒性:冻干处理前后的脱细胞血管材料均无细胞毒性,在材料的周围未发现内皮细胞的接触或者生长抑制,测试样本周围的内皮细胞形态正常,共培养的血管内皮细胞增殖旺盛(图8、9)。
2.3 正常血管与冻干处理后脱细胞血管基质的胶原含量的测定:血管材料的羟脯氨酸含量各组两两相比无统计学意义(P>0.05),即血管材料在上述各处理条件组中,其羟脯氨酸含量(胶原含量)与冻干处理前相比无明显变化,见表1。
2.4 材料的机械力学特征:血管材料的最终抗张强度与缝线保留强度各组两两相比无统计学意义(P>0.05),即血管材料在上述各处理条件组中基本力学特征在经冻干处理前后无明显变化,见表2。
2.5经过冻干处理后血管支架材料体内生物相容性
2.5.1 术区情况及植入材料大体外观:家兔腹部皮下埋植冻干处理脱细胞血管支架后,精神、食欲均良好。手术区术后第2天或第3天出现轻微红肿,术后第4天到第5天消退,埋植处高出周围皮面。切口均愈合良好,术后7天拆线。未发现明显红肿,无脓性分泌物等情况。手术后埋植脱细胞血管支架而隆起的高度随时间的推移逐渐降低,到术后3周时已基本与周围皮肤一致。
大体观察:1周组材料体外可触及、轮廓清晰、质地中、血管浸润明显、纤维包膜可与材料分离(图10)。3周组材料外周包膜变薄,与支架材料结合紧密,材料表面有降解吸收现象,失去网状状结构。4周组材料几乎完全被吸收,材料周围组织无明显坏死及感染。
2.5.2 植入材料组织学检查:2周组未经冻干处理的脱细胞血管基质及经冻干处理的脱细胞血管基质材料HE染色镜下仅见少量中性粒细胞浸润(图11、12)。3周后炎细胞数明显下降,与其下组织分界不清,包膜和材料中有中性粒细胞、淋巴细胞和浆细胞为主的炎性细胞浸润并伴增生的成纤维细胞。4周组材料进一步吸收变薄,呈稀疏的线条状,浸润炎性细胞数量明显减少。两组材料体内反应过程基本相同,各组均未见组织坏死。植入材料大体外观及组织学检测结果表明,脱细胞血管基质在冻干处理前后具有良好的体内生物相容性。
3讨论
传统生物材料的保存方法主要有深低温冻存和冷冻干燥保存两种。对于冻干保存生物材料的生物学特性的研究国内外已不少见,但多集中在眼角膜、骨骼及皮肤等片状材料方面。对于脱细胞血管基质支架此类管状生物材料的生物力学和化学特性影响的研究,国内外尚无文献报道。因此在我们的研究中将冷冻干燥技术应用到脱细胞血管支架此类管状生物材料的保存处理中, 以评估冻干技术作为脱细胞血管支架材料长期保存方法的可行性。
真空冷冻干燥技术是将真空技术、冷冻技术和干燥技术结合起来的一种综合性技术。其最先应用于血浆、血清、酶制剂、生物细胞、人体组织等生物制品和材料的冻干保存。早期的研究发现,部分蛋白制品通过冷冻干燥技术处理后的真空包装可以达到在室温下保存两年甚至更长时间而不发生变质的良好效果[4],从最早应用于处理生物学材料[5],后历经应用氟利昂-12改良处理法[6],直到今天使用冻干同种异体骨成功修复牙周骨缺损[7], 利用冻干技术制备多孔的组织工程支架材料[8]。冻干技术在组织保存及材料制备方面的研究走过了近六十年的发展历程。
冷冻干燥处理对于脱细胞血管材料的生物学特性的影响是本试验中主要的考察指标。主要包括材料的细胞毒性、生物力学以及生物相容性等。在我们的研究中,对经冷冻干燥保存处理的脱细胞血管基质材料的上述指标进行了体外和体内的测试。通过体外试验,我们利用兔的血管内皮细胞对经冷冻干燥处理并保存后的脱细胞血管支架的接触细胞毒性进行检测。结果发现:经过冻干保存处理的脱细胞血管基质其材料毒性并未增加,材料周围未内皮细胞形态正常且未发现内皮细胞的接触或者生长抑制。由此我们可以得出:经过冷冻干燥处理并保存的脱细胞血管基质在体外具有良好的细胞生物相容性。另外在体内试验中,我们在兔腹部皮下埋植脱细胞血管支架,通过对不同时间段取材的组织及形态学分析,初步证实了冷冻干燥处理前后,脱细胞血管支架材料都具有良好的体内生物相容性。
脱细胞血管基质的主要成分为胶原纤维,而胶原纤维的主要分解产物为羟脯胺酸。因此我们的实验中通过测定冻干保存处理前后材料羟脯胺酸的含量,来判断上述处理是否会破坏支架材料的胶原结构。结果发现经冻干保存处理前后的脱细胞血管支架其羟脯胺酸含量基本一致,从而证明冻干保存处理对于脱细胞血管支架的胶原结构无明显影响。
足够的初始强度和弹性对于组织工程血管支架的材料来说是非常重要和必需的。因此,我们在试验中测试了冻干保存处理前后血管组织的强度和弹性,以判断冻干处理对于脱细胞血管基质材料的主要生物力学指标的影响。体外测试的结果证实经过冻干保存的脱细胞血管支架其强度和弹性虽然出现了轻度的降低,但是这种改变不具有明显的统计学意义。
本研究通过对冻干保存处理前后脱细胞血管支架材料生物化学与生物力学特性的检测分析,初步证明:经过冻干保存处理的脱细胞血管材料,其细胞毒性、生物力学特征以及胶原结构与未经处理前相比没有明显的差异,冻干保存后的材料依然具有良好的生物相容性。因此我们认为:冷冻干燥处理作为组织工程脱细胞血管支架此类管状生物材料的长期储存方法是可行的。
[参考文献]
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[收稿日期]2009-09-16 [修回日期]2009-12-30
编辑/张惠娟
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